蛹虫草提取物联合地塞米松抑制大鼠角膜新生血管

【摘要】  　　目的：观察蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)联合地塞米松中国论文网G`E/\cgc
职称论文发表网 中国论文网_p+u5nD
(dexamethasone,Dex)对大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法：对48只大鼠采用碱烧伤法制作大鼠角膜中国论文网!eHrn,n#Q

"N'[4a3\%]{7i T0新生血管模型，后随机分为3组：A组为模型对照组，B组为CME治疗组，C 组为CME联合Dex治疗组。造模
4Yp2cwW#R0中国论文网0j7onI4W }8}
后每组均隔日注射给药，A组给予生理盐水结膜下注射，B组给予CME 10mg球结膜下注射，C组给予CME
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D/]E0
/__4x8V*zJ Rv010mg球结膜下注射，另外给予0.25g/L Dex滴眼液点眼，3次/d。于术后4，8，14d测量角膜新生血管的
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t5v6hO0}0
zme7pUAw1z0生长面积，并测量角膜组织中VEGF及其mRNA的表达情况。结果：造模后联合用药组的大鼠角膜新生血管
8J%W&Xt5[h3a@9d0中国论文网jb%U?A {$qO
生长面积较模型对照组及CME治疗组明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：CME联合Dex中国论文网oXAqO3H)SO0h

.OL,mL-bC;DM0更能明显抑制碱烧伤所致大鼠角膜新生血管的生长。中国论文网3Y&@Wz)j

_/nV9b;T&N#s0【关键词】  蛹虫草提取物；地塞米松；角膜新生血管；血管内皮生长因子
9SpKD~ME0
-Y"O+Yv&C
G0　　Abstract?AIM: To observe the inhibition effect on rat corneal neovascularizition(CNV)
;gn/EC2?[rY0中国论文网-SCn&L)wr:[} s
by drug combination of the cordyceps militaris extract(CME) and dexamethasone(Dex). 中国论文网c%mk+uU n*~b

T6Z'| l"ymcA0METHODS: CNV model was induced by alkaline burn of the cornea with 1mol/L NaOH. Forty?中国论文网!xq q{O)|lV)_
中国论文网M+@s9E"m)k
eight rats were divided into three groups randomly after modeling, A was model group, B 中国论文网2U E0][+sE a
中国论文网%V'YZi,o+P I^*W
was CME treatment group, and C was combination treatment group. All groups received
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pQy&F ]&web0medication by subconjunctival injection every other day after alkaline burn, group A 中国论文网&p1w dT~ {`
中国论文网0U2A+k gbQ"{
received saline, group B received 10mg CME, group C also received 10mg CME, and received 中国论文网3]g3u?YQ


i4{Cq3~00.25g/L Dex eyedrops three times each day, each injection volume was set at 0.1mL. On the 中国论文网}(RBF[/{
职称论文发表网
)D/} z
qEZ3U8zX04, 8, 14 days, CNV was observed, and the expression of vascular endothelial growth factor中国论文网`vI!b-X,i4z#{^5oi
中国论文网`7_3^'Db.] X/L [e
(VEGF) and it?s mRNA in the cornea were detected.?RESULTS: After modeling, rat CNV of 中国论文网:_&r I0lap

7GS+JTX?&? [c0the combination group was significantly reduced than the model control group and CME
TR$U-b|3J@0中国论文网^G/z s)w%g
treatment group, the differences were statistically significant (P<0.05).CONCLUSION:CME 中国论文网\6^O5mi"L
中国论文网k{r(d!vT9p
combining with Dex can inhibit alkaline burn?induced CNV growth more effectively.中国论文网6fu)TdGk?
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　　KEYWORDS: cordyceps militaris extract; dexamethasone; corneal neovascularizition;
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u1] p-\L Zs0vascular endothelial growth factor中国论文网$Q Sq7E9mJ
中国论文网2w s4Q J0IH
　　0　引言
9W)qlusEJ0vCOX0   中国论文网e@}#QLs
　　角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV) 是常见的致盲性眼病之一,也是角膜移植术后
'Z#qu%|[s0中国论文网*]%v$a6kJ:qP
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发生排斥反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上的主要治疗手段,但其易诱发角膜穿孔、中国论文网7d-r$w/T:t!K"b0Y9a v

x;tI
Z-S'x$]!]"k0青光眼、白内障等严重并发症，因而寻找安全有效的治疗CNV的药物一直是眼表研究的热点。蛹虫草主中国论文网1E@jv|4C%x

.I0N ?*pY(} S0要用于抗肿瘤和增强免疫等治疗，近来国外有报道其有抗新生血管生成的作用，但尚未见有抗眼部新生
n,My-N@B0中国论文网 [&Z
xK8W"{
血管的报道。我们的前期研究已证实，蛹虫草提取物（cordyceps militaris extract,CME）对大鼠CNV中国论文网 s*Gxm?6sr
中国论文网 M3O-_N6V!K8ZjbE
具有抑制作用，其高剂量与0.5g/L地塞米松(dexamethasone，Dex)的抑制作用相当。我们将 CME与Dex中国论文网)@$j:isW(i#M
中国论文网XCg;ly0?x_&N
联合用药，观察对大鼠CNV的抑制作用。中国论文网5RBD*zj&w

y:T3_fk|ur0　　1　材料和方法中国论文网K8X \`9PX3FC s'G

"EH+g }[0　　1.1　材料
!{,Qq"zlw8u0
N&D xqg-S;_I0　　蛹虫草子实体，购自广东冬草堂虫草有限公司；0.25g/L Dex滴眼液，购自湖北潜江制药有限责任中国论文网VyQI"nSH8dB"\
中国论文网BKD't/\t ^|
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公司。清洁级健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠48只(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供) ,
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R1abqeb/r
m3wa0体质量220～250g。CME的制备采用水热回流提取法[1]：取蛹虫草子实体粉末50g，加10倍量的蒸馏水（中国论文网.y4[wcfTZ
职称论文发表网 中国论文网D {X)N#u8y SF*d
500mL）于80℃热回流提取3 次，每次90min。合并滤液，减压浓缩，真空干燥器内干燥至粉末，4℃保
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F2m-{S&Y?0中国论文网!YIrE0V"fF"JPq
存备用。0.25g/L Dex滴眼液，采用潜江制药公司生产的滴眼液原液。图1大鼠碱烧伤后14d CNV生长情
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s\N8|%jXG0况  A：模型对照组；B：CME治疗组；C：CME+Dex治疗组。中国论文网%D5hNO4kd

(aKibT0　　1.2　方法
k(X.[jG(XI w0中国论文网+j+[r nx)K3|
　　采用100g/L水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，所有实验大鼠均选择右眼，裂隙灯下检查眼前节无病变
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i#K9KZ+}5G^$C"n1R0。10g/L地卡因眼液表面麻醉，将统一规格直径3.0mm的单层圆形滤纸浸入浓度为1mol/L氢氧化钠溶液
Z!^ L+d6K3d0中国论文网C:q$o*BX%f
20s，吸干滤纸上残余溶液后将其准确贴附于右眼角膜中央表面40s，取下滤纸后立即用生理盐水冲洗
4Kv0|5]2` J|7l0
,@0T,I1g K2|w+nM02min。烧伤术后即观察大鼠右眼角膜，烧灼区域呈灰白色混浊，依据评分标准[2]确认中度碱烧伤模型
e!M,rD5k$`'yS2RW#tR0
-IR0R;X;d-HO2b;a0建立。术后术眼点红霉素眼膏预防感染。抽签法随机将大鼠分成A,B,C 3组（A组:模型对照组；B组：
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v4?F-G|~p/r0中国论文网ZJ$UP?JvRS
CME治疗组；C组：CME+Dex治疗组），每组15只。A组给予生理盐水0.1mL球结膜下注射。B组给予CME 中国论文网w
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中国论文网|2Gl.k2Cz]Q:k
10mg经无菌注射用水稀释为0.1mL后行球结膜下注射。C组给予CME 10mg球结膜下注射，另给予0.25g/L
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Dex滴眼液点眼，3次/d。每组均自术日起隔日球结膜下注射，给药至处死取材为止。于术后第4,8,14d中国论文网s2C5r-\`xHO!i
中国论文网-\%x-f6Q*I,ep^
采用过量麻醉法处死大鼠,每次6只,迅速摘除眼球,在显微镜下剪下带1mm宽巩膜的角膜组织,平分为二，
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均置于?80℃低温冰箱备用，一份用于real time PCR检测VEGF基因水平的表达，另一份用于ELISA检测
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VEGF蛋白水平的表达。中国论文网-kP Z?R-d__
中国论文网D(l2_I*O;q I)j
　　1.2.1　CNV的定量分析
v ^'l,F+Y;Ax0中国论文网O4UW*q!A$r"B6u
　　角膜烧伤后各时间点行裂隙灯显微镜检查，测量新生血管长入角膜的长度及累及角膜圆周的钟点数
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W3~N,bg.[0，计算其面积。新生血管面积计算依据Robert公式[3]:S=C/12×3.1416[r2? (r?l)2],其中C代表新生
Zq2mLzJdpe+K8l0中国论文网9xp\Vk*R M)C
血管累及角膜圆周的钟点数, l代表新生血管的长度（在显微镜下用游标卡尺测量，测量生长较长、弯中国论文网 NW axf`%Iv?;]

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M*b{k0曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管）, r代表角膜半径。中国论文网*u6b"a al+L8t
　1.2.2　角膜VEGFmRNA表达的检测 职称论文发表网
PV(c'x M4pe0
}$R,B-`)x#J{5upy0　　角膜总RNA提取参照Trizol说明书(大连宝生物公司)，对保存在?80℃冰箱中的角膜组织总RNA进行中国论文网(Q3D9\ j4f D
中国论文网!`e!a+Fef
提取与纯化,然后逆转录为 cDNA。Real time PCR 按照试剂盒(大连宝生物公司)说明书进行操作,采用
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]b R_'t(nlm!K025μL反应体系,以β?actin 为内参照。PCR反应条件: 95℃预变性30s, 95℃5s, 60℃ 30s,循环40次中国论文网 ZB1z$wq!Le2uf]
中国论文网xG vS:l
。每例样本均设3个平行复孔，取均值。VEGF和β?actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。VEGF上中国论文网Z"^iGaSDz.?
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游引物: 5?GTCCTCACTTGGATCCCGACA?3?, 下游引物: 5??CCTGGCAGGCAAACAGACTTC?3?,扩增片断中国论文网"Sp:A~
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中国论文网]E\Pkbyj0n
为99bp;β?actin上游引物: 5??GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3?,下游引物: 5??中国论文网lvjbvy
中国论文网5?Dh:K$SE7^ T
GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3?,扩增片断为150bp。中国论文网sFyKxT;yip;t
中国论文网JQe x|6kY7i
　　1.2.3　角膜VEGF表达的检测 中国论文网 N;W(YIV2ho!s

!O&Da$s/Q~b$z2i0　　经电子天平称量，所有标本每个定量为0.005g。将标本放入研钵，加0.01mol/L PBS缓冲液100μL
:}R_2Fbaz0
2wV)q`b"t.r0研磨匀浆，使之呈现混悬液状，装入EP管，4℃ 5000r/min离心10min，收集上清液，?80℃冷冻保存，
U)a,o%b [LG4i)c0
PMO:QDO0g0夹心法ELISA检测。中国论文网-E7m"G2qK2? c0p
   中国论文网-Q;L5{([+hm-rbDB
　　统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，总体均数间比较采用单因素方差分析
fkpG7T7`0中国论文网)Wr$`*h0rCj/R\E
，各组均数间两两比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义。
a eN1c@:z0
U ?.K;gn0　　2　结果中国论文网/A8pU*D]

1I7tiL5J ~x0　　2.1　CNV生长面积 中国论文网3qb!K+j$^M2b1Pb1hx
中国论文网+?HH(e `n0y)F
　　模型对照组于角膜烧伤后3d开始长入新生血管，CME组与联合用药组于烧伤后4d开始长入新生血管中国论文网kv!DC#k!lnt

){`1ChudD,S~0，均于8d左右生长速度达高峰，其后生长变缓，到两周时部分CNV开始消退(图1)。在烧伤后4,8,14dCME
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z7R&Q'^oV0治疗组与联合治疗组CNV面积均小于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），联合治疗组与CME治中国论文网m/y!^'Y'Ly
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中国论文网 Fl'@-qf`o
疗组比较，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。统计结果显示，联合治疗组更能明显抑制CNV的生长(表
!@\&d#F)Vc4z0中国论文网#{~b'wRr?
1)。表1大鼠CNV面积和VEGF表达水平（略）中国论文网/gRHavM3h,G{ |
中国论文网I:LA?x K.\Qq
　　2.2　角膜VEGFmRNA的表达 中国论文网1qWRkq i,c"{
中国论文网,dA;[-x8l8M?:Z
　　烧伤后B，C组mRNA的表达明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B，C组之间差异亦
8B9t2oQ H|0中国论文网e5vUxr0SNF7d
具有统计学意义 (P<0.05，表1)。中国论文网SkM3Gi\)z
中国论文网h'_7SXB\
　　2.3　角膜VEGF的表达 中国论文网,sR9oIY0G rc D7iI
中国论文网V)YH+Y3[DpX{3j
　　在各时间点联合用药组较模型对照组及CME组均低表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，表1)，这
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JI/E~L
a:coiR0与VEGFmRNA表达水平具有一致性。中国论文网/n?"RK#iJ8aV

*iz-W!ka'l-jo0　　3　讨论
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^e-g"?!GB/B0　　CNV属于难治性角膜疾病之一，常常导致患者视力下降，严重者可致失明。蛹虫草是一种名贵的中中国论文网6Y Q{!K8_HA%r

)gwK0J2eJk0药材，其应用于临床有悠久的历史。近年来的研究显示，蛹虫草具有抗癌、调节免疫、抗理作用[4?6]中国论文网a?XK\(p)\Ad,a)}
中国论文网P.I"t%I-ykx
。最近国外的研究显示，CME能够抑制新生血管的发生，它能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 [7]和鸡胚中国论文网0Ae7@|5rn mh`

[ D:@0P _,V2i0绒毛尿囊膜的血管生成[8]。我们前期的研究显示，CME能够有效抑制碱烧伤所致的大鼠CNV的生长，高中国论文网#A*_)^*?'|Y
职称论文发表网 中国论文网/uYj#E*l%a_,G
剂量抑制作用与0.5g/L的Dex 相当。我们仍然采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型，联合运用CME及Dex，观
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e0中国论文网,nL8|e @#miAGTP
察联合用药对CNV生长的抑制作用及其副作用的大小。实验结果显示，联合用药比CME单独用药更能有效中国论文网k [#f"{4G`
中国论文网hQ PVmS
抑制大鼠CNV的生长，且副作用不明显。这就提示，如能将蛹虫草开发成有效的抑制新生血管的药物，中国论文网^NI-^W
中国论文网|d(b3z6R B!WV#Z
在治疗上辅以低浓度的糖皮质激素，可以明显提高治疗效果且有效降低副作用，从而为CNV的药物治疗
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0T+B_v c0{rx0提供新的思路。
MV{'A&Ef/X0
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