【摘要】 目的：观察蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)联合地塞米松
中国论文网6p)b q:nZ Ptw;S7e职称论文发表网 中国论文网~_,B6JT2m(dexamethasone,Dex)对大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法：对48只大鼠采用碱烧伤法制作大鼠角膜
中国论文网;s0N/QM1f1YN t9l I$Z(] Q,zx8{*\} Ft1w%M0新生血管模型，后随机分为3组：A组为模型对照组，B组为CME治疗组，C 组为CME联合Dex治疗组。造模
5{
ghaTG0中国论文网I5U[kH%h)\B后每组均隔日注射给药，A组给予生理盐水结膜下注射，B组给予CME 10mg球结膜下注射，C组给予CME
中国论文网U w ~%k oO中国论文网p8h)x%} {XDB9h10mg球结膜下注射，另外给予0.25g/L Dex滴眼液点眼，3次/d。于术后4，8，14d测量角膜新生血管的
-Z Gh8|ir2F0k/u7J3v(d gXZ+K
B0生长面积，并测量角膜组织中VEGF及其mRNA的表达情况。结果：造模后联合用药组的大鼠角膜新生血管
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y f)t C1^&B1]0Q0生长面积较模型对照组及CME治疗组明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：CME联合Dex
0k3e&^ Y `%o\A?0 k7L5ac+y'L;W{0更能明显抑制碱烧伤所致大鼠角膜新生血管的生长。
中国论文网b{ w:Y qn#U"s b#y(Vr0【关键词】 蛹虫草提取物；地塞米松；角膜新生血管；血管内皮生长因子
[Q(vP{q4v0 ` n8Dj(^b `X0 Abstract?AIM: To observe the inhibition effect on rat corneal neovascularizition(CNV)
中国论文网;H$c$\#DO6t`_^5\0{7@
T0by drug combination of the cordyceps militaris extract(CME) and dexamethasone(Dex).
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ye YkU0中国论文网n,zO6qv*LMETHODS: CNV model was induced by alkaline burn of the cornea with 1mol/L NaOH. Forty?
中国论文网"g rb{ s|;k"\中国论文网
Q w%@r/QJ }6J#r^eight rats were divided into three groups randomly after modeling, A was model group, B
中国论文网nDkM$B!s~!k@ B] Mm&b^ e0was CME treatment group, and C was combination treatment group. All groups received
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c#|a eR
|T:M8s0medication by subconjunctival injection every other day after alkaline burn, group A
中国论文网 p'T N9PP~中国论文网U0t+I Y,WX`received saline, group B received 10mg CME, group C also received 10mg CME, and received
5N kF)y0J#` L0\4g07W-q4uZ!X H8Z00.25g/L Dex eyedrops three times each day, each injection volume was set at 0.1mL. On the
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|9oV2i(z职称论文发表网 中国论文网1j~
W DRj;wP;IJ1fU]4, 8, 14 days, CNV was observed, and the expression of vascular endothelial growth factor
f&\2C@M6d:T0中国论文网5G7~o T fr!je:N(VEGF) and it?s mRNA in the cornea were detected.?RESULTS: After modeling, rat CNV of
中国论文网 b6B$I]
y"q vH1Ok0T P1s9O\"uL-D0the combination group was significantly reduced than the model control group and CME
3j)|us q2[0n/v q2PA'~/]
e0treatment group, the differences were statistically significant (P<0.05).CONCLUSION:CME
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T,].Z中国论文网 h onEjZ-~%O*W.wcombining with Dex can inhibit alkaline burn?induced CNV growth more effectively.
中国论文网~:l;@ ]9b+I:]?
K8L+UN1g$s `0 KEYWORDS: cordyceps militaris extract; dexamethasone; corneal neovascularizition;
vg k.d @$m~+H e [0中国论文网,TH!Lke X5e Svascular endothelial growth factor
T `4A*VZ)x'l;I-z0中国论文网I,M`;S#N5g:L)_C 0 引言
h`(\q)Q)a-is0 ;P!U xS @1L0 角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV) 是常见的致盲性眼病之一,也是角膜移植术后
中国论文网BK&sw(`2t$~b7h*W3^,uE mlM1{0发生排斥反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上的主要治疗手段,但其易诱发角膜穿孔、
中国论文网?*};J6T$ML3\]*c
u;K4VLJul0青光眼、白内障等严重并发症，因而寻找安全有效的治疗CNV的药物一直是眼表研究的热点。蛹虫草主
中国论文网&E v$NP+\!{;iDBn:k,O1yB ^Du0要用于抗肿瘤和增强免疫等治疗，近来国外有报道其有抗新生血管生成的作用，但尚未见有抗眼部新生
中国论文网7n.y;Xv6D中国论文网*fr+Lu,h!i/X u8v血管的报道。我们的前期研究已证实，蛹虫草提取物（cordyceps militaris extract,CME）对大鼠CNV
中国论文网
Y)X l T z VU中国论文网2U i"v7@N4v'zm具有抑制作用，其高剂量与0.5g/L地塞米松(dexamethasone，Dex)的抑制作用相当。我们将 CME与Dex
1h4qH*ED'W6n0中国论文网%~.t&V_(F S联合用药，观察对大鼠CNV的抑制作用。
中国论文网7YD.~)w1I1j+C#l中国论文网
iB9u9NNZ6p T 1 材料和方法
中国论文网 l a Y\s;u[ ^中国论文网 R4WQ f5P ]n!b'H 1.1 材料
中国论文网 u2\x#q}$GpXs|rWKz0 蛹虫草子实体，购自广东冬草堂虫草有限公司；0.25g/L Dex滴眼液，购自湖北潜江制药有限责任
"hnd:k$l&{.w~r2O U0 LX){3Hiy%p/?0公司。清洁级健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠48只(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供) ,
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|&B0中国论文网*K$m@ k:}4^'J体质量220～250g。CME的制备采用水热回流提取法[1]：取蛹虫草子实体粉末50g，加10倍量的蒸馏水（
中国论文网 H {|n/b?
SWb职称论文发表网 4F3t$JUEWM(S-T0500mL）于80℃热回流提取3 次，每次90min。合并滤液，减压浓缩，真空干燥器内干燥至粉末，4℃保
中国论文网 Z q*f3}$eqh中国论文网mW5vgqC存备用。0.25g/L Dex滴眼液，采用潜江制药公司生产的滴眼液原液。图1大鼠碱烧伤后14d CNV生长情
中国论文网-IY%oA2i"hvA*t(U$L
w0e0况 A：模型对照组；B：CME治疗组；C：CME+Dex治疗组。
B!_ T WQ7d*b C0中国论文网+c6tDPVeb 1.2 方法
:C.]5qq/B.F;L!o_01}0~ }D;XOzW0 采用100g/L水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，所有实验大鼠均选择右眼，裂隙灯下检查眼前节无病变
g)\K$ag6^_(F'|0m:wQ5_4~1G.H
`7^ ^{0。10g/L地卡因眼液表面麻醉，将统一规格直径3.0mm的单层圆形滤纸浸入浓度为1mol/L氢氧化钠溶液
中国论文网mPy to+@1W M
mZ中国论文网C5|&g!F C&ntA20s，吸干滤纸上残余溶液后将其准确贴附于右眼角膜中央表面40s，取下滤纸后立即用生理盐水冲洗
Y og[N;Dd.D[ K~3t0y{)H#@oZ9vTtn)P02min。烧伤术后即观察大鼠右眼角膜，烧灼区域呈灰白色混浊，依据评分标准[2]确认中度碱烧伤模型
中国论文网5[ Ic&@6a
Y:H中国论文网5P we9f([J(X建立。术后术眼点红霉素眼膏预防感染。抽签法随机将大鼠分成A,B,C 3组（A组:模型对照组；B组：
;uNW)L/O2LV6d0Py0DG"D!q0I6O&k/[6^0CME治疗组；C组：CME+Dex治疗组），每组15只。A组给予生理盐水0.1mL球结膜下注射。B组给予CME
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t0中国论文网!}m8i N_ [R{10mg经无菌注射用水稀释为0.1mL后行球结膜下注射。C组给予CME 10mg球结膜下注射，另给予0.25g/L
中国论文网 v+q`-B;G3l4Z中国论文网K0aa\YDex滴眼液点眼，3次/d。每组均自术日起隔日球结膜下注射，给药至处死取材为止。于术后第4,8,14d
中国论文网4j d/Cg3W gH@mU中国论文网/F*y g x9q采用过量麻醉法处死大鼠,每次6只,迅速摘除眼球,在显微镜下剪下带1mm宽巩膜的角膜组织,平分为二，
中国论文网 }s.W SZ
b8zOf中国论文网8U#N P'[dq0[*BCr均置于?80℃低温冰箱备用，一份用于real time PCR检测VEGF基因水平的表达，另一份用于ELISA检测
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n D3a%g%uhVEGF蛋白水平的表达。
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zt0U^ [中国论文网9w{h ?;E)_3d[/| 1.2.1 CNV的定量分析
,{f u2\%{00VoT-}y G0B0 角膜烧伤后各时间点行裂隙灯显微镜检查，测量新生血管长入角膜的长度及累及角膜圆周的钟点数
中国论文网q H v9V6M8L0T中国论文网A M(Opaf M#f q，计算其面积。新生血管面积计算依据Robert公式[3]:S=C/12×3.1416[r2? (r?l)2],其中C代表新生
中国论文网l'LN8]4V(k
r:H7C I2|zYq ?;AK0血管累及角膜圆周的钟点数, l代表新生血管的长度（在显微镜下用游标卡尺测量，测量生长较长、弯
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{&EYfk0o`8j5A,_
M%Q0曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管）, r代表角膜半径。
9?ytC1{8R
E0 1.2.2 角膜VEGFmRNA表达的检测
职称论文发表网 i;W0z6V ~zNy)S0中国论文网0Ub
AZ1Vc
]&\ 角膜总RNA提取参照Trizol说明书(大连宝生物公司)，对保存在?80℃冰箱中的角膜组织总RNA进行
中国论文网 dB7dGtt中国论文网 E7|:p4Q!|
u&X%d&_ C提取与纯化,然后逆转录为 cDNA。Real time PCR 按照试剂盒(大连宝生物公司)说明书进行操作,采用
中国论文网}8y%W5zcq;@5F中国论文网)H` m)A/g!x%n5{Z25μL反应体系,以β?actin 为内参照。PCR反应条件: 95℃预变性30s, 95℃5s, 60℃ 30s,循环40次
中国论文网*f+?%wO,[iK-g中国论文网;r+p%Z#yp2Pz。每例样本均设3个平行复孔，取均值。VEGF和β?actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。VEGF上
中国论文网 v7L0X9v-zp1b Q中国论文网`5u&["[/U5I~游引物: 5?GTCCTCACTTGGATCCCGACA?3?, 下游引物: 5??CCTGGCAGGCAAACAGACTTC?3?,扩增片断
中国论文网V.n'I}
dP;B(T(S3v i C7]/r rH0为99bp;β?actin上游引物: 5??GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3?,下游引物: 5??
中国论文网x(c:q ~`0J7Q/N*\&O(L IX4mf
S| wr0GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3?,扩增片断为150bp。
中国论文网 @ } K:q e+Hk:y iRH {m4ck
pv0 1.2.3 角膜VEGF表达的检测
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}8v'dzL({[
bks E3i4lLD0 经电子天平称量，所有标本每个定量为0.005g。将标本放入研钵，加0.01mol/L PBS缓冲液100μL
.A#I+FS F:K0N0#Ol
DiW5r0研磨匀浆，使之呈现混悬液状，装入EP管，4℃ 5000r/min离心10min，收集上清液，?80℃冷冻保存，
_"o5?uH;B-|5a!uFM0/uNj*{;w ZRC0夹心法ELISA检测。
,r4I i#MJT6af0 中国论文网;c Hm
Dw T0A&u/e*KO 统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，总体均数间比较采用单因素方差分析
hm w q4Q#?$z0中国论文网Jm8Y$F8r`(r，各组均数间两两比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义。
中国论文网c!B _2V!I*fw|*pj S h"KW A;~:S0 2 结果
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}&] f4[#r0 2.1 CNV生长面积
X { G/B.k#a K~0中国论文网 h/O-B5_|9e#T W 模型对照组于角膜烧伤后3d开始长入新生血管，CME组与联合用药组于烧伤后4d开始长入新生血管
'C/[ zv0R!U S d0中国论文网_ b cB'[ _4i，均于8d左右生长速度达高峰，其后生长变缓，到两周时部分CNV开始消退(图1)。在烧伤后4,8,14dCME
中国论文网]{q|3B中国论文网
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^7]%nu4yG治疗组与联合治疗组CNV面积均小于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），联合治疗组与CME治
mR,Vh({/m M
@0ow-y*gg D ?0疗组比较，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。统计结果显示，联合治疗组更能明显抑制CNV的生长(表
Fq2DO"G"K6_0&]g'R$g N~&J01)。表1大鼠CNV面积和VEGF表达水平（略）
)K7|(Zl S+M0中国论文网 X R
[]+bx Q 2.2 角膜VEGFmRNA的表达
中国论文网E_ E1C| d#sT,k5QF h,J$H0 烧伤后B，C组mRNA的表达明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B，C组之间差异亦
中国论文网{2U@ f.?;\x)iz中国论文网#\k9[Cl9n具有统计学意义 (P<0.05，表1)。
2X9t6fk"W:N'DN`0中国论文网Z1P BWI m @c Hr 2.3 角膜VEGF的表达
中国论文网t:U'R]~&Ax5^中国论文网;k&V7](gIb:aY3\ s 在各时间点联合用药组较模型对照组及CME组均低表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，表1)，这
中国论文网)E B h m"Y wf FBw中国论文网@ b/f
`1[E与VEGFmRNA表达水平具有一致性。
中国论文网9\l0L'Y%@O'P中国论文网&GS0B6_`
xK7]N9|5P 3 讨论
中国论文网4Cw'H8Q q
k/sr中国论文网6I
k? v
L CNV属于难治性角膜疾病之一，常常导致患者视力下降，严重者可致失明。蛹虫草是一种名贵的中
中国论文网 i3[a-p9A5T _中国论文网 P#Ab(t,r药材，其应用于临床有悠久的历史。近年来的研究显示，蛹虫草具有抗癌、调节免疫、抗理作用[4?6]
0S#W r.D![;UU
^P0中国论文网vq n$R
Wf。最近国外的研究显示，CME能够抑制新生血管的发生，它能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 [7]和鸡胚
eE-f.sr5u-pf0中国论文网W(BqV$T)[]'Rv c绒毛尿囊膜的血管生成[8]。我们前期的研究显示，CME能够有效抑制碱烧伤所致的大鼠CNV的生长，高
wW'IIb dK#J]/R
W0职称论文发表网 `^(p.P8WGy^9[}0剂量抑制作用与0.5g/L的Dex 相当。我们仍然采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型，联合运用CME及Dex，观
]"{W^7[0S
W"vR0`.H ~c qm2z0察联合用药对CNV生长的抑制作用及其副作用的大小。实验结果显示，联合用药比CME单独用药更能有效
中国论文网 ak&F,Qm中国论文网 |)F'@ K1m#d?;y抑制大鼠CNV的生长，且副作用不明显。这就提示，如能将蛹虫草开发成有效的抑制新生血管的药物，
中国论文网qt rK tb:oP)YE V%H8o'O9q0在治疗上辅以低浓度的糖皮质激素，可以明显提高治疗效果且有效降低副作用，从而为CNV的药物治疗
9s*c5B$U%C Z0中国论文网%lbL|4QQ)]提供新的思路。
` {9w#~$UYs0中国论文网&VCsZ
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|&` Bqf3L9_0 
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