【摘要】 目的：观察蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)联合地塞米松
D3X`3o ]B0职称论文发表网 k
Y E2HG0(dexamethasone,Dex)对大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法：对48只大鼠采用碱烧伤法制作大鼠角膜
_J+R ^&B09K6A o+Tc5y4q0新生血管模型，后随机分为3组：A组为模型对照组，B组为CME治疗组，C 组为CME联合Dex治疗组。造模
&byo*rS Y-m0
I^o ]} PN C MG0后每组均隔日注射给药，A组给予生理盐水结膜下注射，B组给予CME 10mg球结膜下注射，C组给予CME
中国论文网2V,u `@V)x u^+O:A g/l5V f:Ut010mg球结膜下注射，另外给予0.25g/L Dex滴眼液点眼，3次/d。于术后4，8，14d测量角膜新生血管的
中国论文网 c4h+b/`!h]N)H,n+l2J/g!~0生长面积，并测量角膜组织中VEGF及其mRNA的表达情况。结果：造模后联合用药组的大鼠角膜新生血管
中国论文网+to'Z r#m ms6Gy9s中国论文网'B[:gs"U"x Zb生长面积较模型对照组及CME治疗组明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：CME联合Dex
!QG:]T.n.D;H O0o0中国论文网4egC;o [*F更能明显抑制碱烧伤所致大鼠角膜新生血管的生长。
中国论文网Z a)|f5g Jd中国论文网\e C0N5e【关键词】 蛹虫草提取物；地塞米松；角膜新生血管；血管内皮生长因子
中国论文网t7Ku*N)_:aHP中国论文网@(gS H7V m(g |H TT Abstract?AIM: To observe the inhibition effect on rat corneal neovascularizition(CNV)
0Xk
j7\,e_'Cyc0*?C;Y+d1v"ev0by drug combination of the cordyceps militaris extract(CME) and dexamethasone(Dex).
中国论文网pf;H4@ Zv)ehh中国论文网[yM.VW!^A b I[METHODS: CNV model was induced by alkaline burn of the cornea with 1mol/L NaOH. Forty?
中国论文网4a:e
P'WM/]$` j中国论文网6E$dPQ*YVeight rats were divided into three groups randomly after modeling, A was model group, B
:[1s(p^0x0中国论文网.l\'X\-_
Nsc _-{9Hwas CME treatment group, and C was combination treatment group. All groups received
中国论文网2S z.An[8LPm g A$qQ|0medication by subconjunctival injection every other day after alkaline burn, group A
中国论文网
k;dLP,j)c*_ Oa中国论文网
v @utnEIf6|Ytreceived saline, group B received 10mg CME, group C also received 10mg CME, and received
中国论文网 Kj,IZ8`9E1Z e中国论文网%c*Mh}+X$@ Im0.25g/L Dex eyedrops three times each day, each injection volume was set at 0.1mL. On the
中国论文网 @4W;DRx"Db职称论文发表网 中国论文网{;tH2B)z/Gfv!^T4, 8, 14 days, CNV was observed, and the expression of vascular endothelial growth factor
中国论文网Hr_j,G1V1ha KV4{SR&J B0(VEGF) and it?s mRNA in the cornea were detected.?RESULTS: After modeling, rat CNV of
)f
N9V [ Y
x"}0'y b
?z*?;~?0the combination group was significantly reduced than the model control group and CME
中国论文网h3Ck#kf
Z}$i T J kivYa0treatment group, the differences were statistically significant (P<0.05).CONCLUSION:CME
Fq
J3H-jd|5X,R0中国论文网r{+L8LM"p5zM)BScombining with Dex can inhibit alkaline burn?induced CNV growth more effectively.
]1@f+a@+aZ5A0?
中国论文网oxU:fnV V v p KEYWORDS: cordyceps militaris extract; dexamethasone; corneal neovascularizition;
中国论文网7Y5g&V \$N中国论文网 D |8iy l$aAvascular endothelial growth factor
?5I/D#D@c~ w0中国论文网8NO6s$vqWU 0 引言
F xt/`}+a8G0 ,uQ0}+q5p M A%_`0KA0 角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV) 是常见的致盲性眼病之一,也是角膜移植术后
中国论文网!y@I&U\NLJ!KrB9\:P O!F ~0发生排斥反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上的主要治疗手段,但其易诱发角膜穿孔、
[T
Q{l%k%v*V0中国论文网&?R4M wN!C%M&p/AT$f J青光眼、白内障等严重并发症，因而寻找安全有效的治疗CNV的药物一直是眼表研究的热点。蛹虫草主
s u;G:e1S09S3sz.k)z9_X#^.?7K0要用于抗肿瘤和增强免疫等治疗，近来国外有报道其有抗新生血管生成的作用，但尚未见有抗眼部新生
)D:R&K&})`/x;]04Agr7s%qjHwf0血管的报道。我们的前期研究已证实，蛹虫草提取物（cordyceps militaris extract,CME）对大鼠CNV
[Rs| I6j9HB/[0中国论文网`$h:t.vFC.W(od/{具有抑制作用，其高剂量与0.5g/L地塞米松(dexamethasone，Dex)的抑制作用相当。我们将 CME与Dex
7nW
_8@T0中国论文网@bN PW&n联合用药，观察对大鼠CNV的抑制作用。
中国论文网q n)o:g5T f_-~ z中国论文网
p5`b0B/|+|%\y` 1 材料和方法
\W s3uU]0:s6ch2] lU
u0 1.1 材料
1a%aP'h-poJ)]-G*x r0(G:l+IKL p
F0 蛹虫草子实体，购自广东冬草堂虫草有限公司；0.25g/L Dex滴眼液，购自湖北潜江制药有限责任
中国论文网7O
[&n n,{)J/EMVK.EE.s1ct)`W,H0公司。清洁级健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠48只(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供) ,
qI$? y V\7^0F6C5EZ*D0体质量220～250g。CME的制备采用水热回流提取法[1]：取蛹虫草子实体粉末50g，加10倍量的蒸馏水（
[g U8s HA0职称论文发表网 0@-~ x2\1e F#Y0500mL）于80℃热回流提取3 次，每次90min。合并滤液，减压浓缩，真空干燥器内干燥至粉末，4℃保
中国论文网{8e!nS He\uv:^1^中国论文网+RH1li1kX.{/h"q存备用。0.25g/L Dex滴眼液，采用潜江制药公司生产的滴眼液原液。图1大鼠碱烧伤后14d CNV生长情
中国论文网 f%YO6X
GX)H:kb
nfO&@:WC+r0况 A：模型对照组；B：CME治疗组；C：CME+Dex治疗组。
中国论文网 ]8l"P8tc&m
F3A中国论文网 Q s.upuq2Y 1.2 方法
中国论文网%g s8d T1wC7s$P"Qx0 采用100g/L水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，所有实验大鼠均选择右眼，裂隙灯下检查眼前节无病变
中国论文网A"Ao
Tx*M:SWc"ke.V Jf0。10g/L地卡因眼液表面麻醉，将统一规格直径3.0mm的单层圆形滤纸浸入浓度为1mol/L氢氧化钠溶液
中国论文网1Xl1o-O [1d i^ y~(qmYIM IU020s，吸干滤纸上残余溶液后将其准确贴附于右眼角膜中央表面40s，取下滤纸后立即用生理盐水冲洗
E
q P M:R
d${g6W0中国论文网
_-AVf R2min。烧伤术后即观察大鼠右眼角膜，烧灼区域呈灰白色混浊，依据评分标准[2]确认中度碱烧伤模型
中国论文网 TI+GJ?[K+Z中国论文网,o${x\8I p+Y建立。术后术眼点红霉素眼膏预防感染。抽签法随机将大鼠分成A,B,C 3组（A组:模型对照组；B组：
f8YwoyTb0d]f U)b@m:Z'~ uD0CME治疗组；C组：CME+Dex治疗组），每组15只。A组给予生理盐水0.1mL球结膜下注射。B组给予CME
中国论文网$`6{2CBo0]x
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w'yu oyr10mg经无菌注射用水稀释为0.1mL后行球结膜下注射。C组给予CME 10mg球结膜下注射，另给予0.25g/L
7b4~Hq4V:t3[0;YT s s KG2~0Dex滴眼液点眼，3次/d。每组均自术日起隔日球结膜下注射，给药至处死取材为止。于术后第4,8,14d
中国论文网:w
Ro? LrR:w|&k P-K^Y9~0采用过量麻醉法处死大鼠,每次6只,迅速摘除眼球,在显微镜下剪下带1mm宽巩膜的角膜组织,平分为二，
中国论文网 JAi8z$P)[ _&~5s5[ eRC0均置于?80℃低温冰箱备用，一份用于real time PCR检测VEGF基因水平的表达，另一份用于ELISA检测
中国论文网oi@|jcM)f\Uq@b7o `(a Q0VEGF蛋白水平的表达。
中国论文网P(w%W;H}x D
F:I,] hCZ,^0 1.2.1 CNV的定量分析
$g&A;d5B h'N;C2IM0 E.X'JJ;a7Ls1a R a0 角膜烧伤后各时间点行裂隙灯显微镜检查，测量新生血管长入角膜的长度及累及角膜圆周的钟点数
中国论文网?j_ Qt"t B Q_ f4Rn o0，计算其面积。新生血管面积计算依据Robert公式[3]:S=C/12×3.1416[r2? (r?l)2],其中C代表新生
k)\4k k o&Z8u00w|s+[:iC6t9S0血管累及角膜圆周的钟点数, l代表新生血管的长度（在显微镜下用游标卡尺测量，测量生长较长、弯
(L&\[Y0P8r7z3LB2VgUq%j0中国论文网m TX,?*[2wI2h IG曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管）, r代表角膜半径。
中国论文网 `0^ hA.m-`T
S 1.2.2 角膜VEGFmRNA表达的检测
职称论文发表网 中国论文网/mng6V"~中国论文网z `0]FE6ri)z 角膜总RNA提取参照Trizol说明书(大连宝生物公司)，对保存在?80℃冰箱中的角膜组织总RNA进行
中国论文网(F-_ h%w e*KJ中国论文网tG3P+p5b%s z提取与纯化,然后逆转录为 cDNA。Real time PCR 按照试剂盒(大连宝生物公司)说明书进行操作,采用
中国论文网E oJ1Gj
|r&R \中国论文网-`X+J2t9O.M*t25μL反应体系,以β?actin 为内参照。PCR反应条件: 95℃预变性30s, 95℃5s, 60℃ 30s,循环40次
XL @ [O B0|Im ^C h.{j0。每例样本均设3个平行复孔，取均值。VEGF和β?actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。VEGF上
"S5d Z z} h0,Be}7jB0游引物: 5?GTCCTCACTTGGATCCCGACA?3?, 下游引物: 5??CCTGGCAGGCAAACAGACTTC?3?,扩增片断
中国论文网4_ ?
r^\/}Uz)U tR c q*V|'P0为99bp;β?actin上游引物: 5??GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3?,下游引物: 5??
中国论文网#f!kK
g6i^J/W R@ Y)q中国论文网4Z2y1k4]i _8QP e;r1i \XGACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3?,扩增片断为150bp。
p0hb)l5NB)z;W G0中国论文网` {y6s:m 1.2.3 角膜VEGF表达的检测
P2H*K4E0zm5wI01l1S
~ N~4Rf:T0 经电子天平称量，所有标本每个定量为0.005g。将标本放入研钵，加0.01mol/L PBS缓冲液100μL
中国论文网7L0g(W5M-~5m*G o?|woj0研磨匀浆，使之呈现混悬液状，装入EP管，4℃ 5000r/min离心10min，收集上清液，?80℃冷冻保存，
(|$|$X;CZ0pV O-O0
es-[ V#A-YO0夹心法ELISA检测。
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E:T%L"t0 中国论文网^#E5a&S i L+O 统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，总体均数间比较采用单因素方差分析
6@L6[_0G1oV8r;`-H0 oc6Lt-x0，各组均数间两两比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义。
7e V(?S |g c]0中国论文网s
D4oq L O
T 2 结果
3OX'n)kg(kT0pgX*bN)G\ @0 2.1 CNV生长面积
V Y
P&h}G? I|0中国论文网&p,\:XO)XD 模型对照组于角膜烧伤后3d开始长入新生血管，CME组与联合用药组于烧伤后4d开始长入新生血管
#`/N8I-y c)V&sj Q#z$y0(a:L
t G2u!E s,X){$c0，均于8d左右生长速度达高峰，其后生长变缓，到两周时部分CNV开始消退(图1)。在烧伤后4,8,14dCME
\0s^*T9piQ0 Xi8nr Y)F l0V0治疗组与联合治疗组CNV面积均小于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），联合治疗组与CME治
中国论文网R J _ ]jD7R/X中国论文网}?)}g V r疗组比较，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。统计结果显示，联合治疗组更能明显抑制CNV的生长(表
中国论文网&h0j9@ hL;B ]2P0l F1D$R01)。表1大鼠CNV面积和VEGF表达水平（略）
b)[F*El*cB/C0n*A08M[1hG v-Z%Cs0 2.2 角膜VEGFmRNA的表达
中国论文网#x6~$|
W/?fiRA3kh中国论文网 q4j*@"@n/G&g 烧伤后B，C组mRNA的表达明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B，C组之间差异亦
中国论文网,V/Xy ` n6nsz IO#j,Y0具有统计学意义 (P<0.05，表1)。
M1s+y/P@B B Z0中国论文网 iOm%J#u w i 2.3 角膜VEGF的表达
中国论文网yA*jy+QxZ i#Xv中国论文网h Fqn Br {!Xc3qh 在各时间点联合用药组较模型对照组及CME组均低表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，表1)，这
'[7w
A'D2vX {r!? w,N0中国论文网.Y7u$tF+p"f^与VEGFmRNA表达水平具有一致性。
0~;G iy/o,`9P] o/p0中国论文网#b!t9a y$P/T.b 3 讨论
0c8ZuO!o0h0E*?v.ek1]
W0H0 CNV属于难治性角膜疾病之一，常常导致患者视力下降，严重者可致失明。蛹虫草是一种名贵的中
中国论文网YnZ)? k ? S8Z `&M3K:A0药材，其应用于临床有悠久的历史。近年来的研究显示，蛹虫草具有抗癌、调节免疫、抗理作用[4?6]
中国论文网g1u3`
i"u'e:r"~ jA j9H G/Ct
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G2W0。最近国外的研究显示，CME能够抑制新生血管的发生，它能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 [7]和鸡胚
J*UV2?.un00dA
FP q.^1w0绒毛尿囊膜的血管生成[8]。我们前期的研究显示，CME能够有效抑制碱烧伤所致的大鼠CNV的生长，高
中国论文网%t7\N
a.|`c职称论文发表网 :lZB/FEn9`g j0剂量抑制作用与0.5g/L的Dex 相当。我们仍然采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型，联合运用CME及Dex，观
a@:r1V U8m1}}0中国论文网:t$gA2mxi9YT+B)\)A察联合用药对CNV生长的抑制作用及其副作用的大小。实验结果显示，联合用药比CME单独用药更能有效
中国论文网(zK!Iz/W x^中国论文网fq5Gz8yT+`抑制大鼠CNV的生长，且副作用不明显。这就提示，如能将蛹虫草开发成有效的抑制新生血管的药物，
0}!]F Xy U nb
s0中国论文网 U{!wu!r K8R3U^在治疗上辅以低浓度的糖皮质激素，可以明显提高治疗效果且有效降低副作用，从而为CNV的药物治疗
7{ko@'A0+x A)]a k.o0ZR0提供新的思路。
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,@z4p&vE
B5ZA0 
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