【摘要】 目的：观察蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)联合地塞米松
#n To$a)dOt"n }P0职称论文发表网 中国论文网5p8Y OWbd(dexamethasone,Dex)对大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法：对48只大鼠采用碱烧伤法制作大鼠角膜
中国论文网7[ TP0` T4p!T6Q中国论文网?gkPF Zj新生血管模型，后随机分为3组：A组为模型对照组，B组为CME治疗组，C 组为CME联合Dex治疗组。造模
中国论文网6N}Y6E B&{ p P W)y"V ^ds0后每组均隔日注射给药，A组给予生理盐水结膜下注射，B组给予CME 10mg球结膜下注射，C组给予CME
6A!c"l2L4r0 W
` F1HP5k010mg球结膜下注射，另外给予0.25g/L Dex滴眼液点眼，3次/d。于术后4，8，14d测量角膜新生血管的
A \@E4r,b0H0中国论文网 ?N#Jt L\i8L I生长面积，并测量角膜组织中VEGF及其mRNA的表达情况。结果：造模后联合用药组的大鼠角膜新生血管
中国论文网{&y){TX4tt,O9Djt中国论文网3F Xo$Q1H&H7~生长面积较模型对照组及CME治疗组明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：CME联合Dex
中国论文网l{5E
~1b3N }4zj)kp b4m(y Q W$Q0更能明显抑制碱烧伤所致大鼠角膜新生血管的生长。
*h4[#mnT0\)A px#@^0中国论文网o!Q;n$a y【关键词】 蛹虫草提取物；地塞米松；角膜新生血管；血管内皮生长因子
中国论文网%F6^ {~@ n(k L)Rc lio5T8|0 Abstract?AIM: To observe the inhibition effect on rat corneal neovascularizition(CNV)
中国论文网#U'Q)]E x_mF中国论文网
}H,[u)ArC0?by drug combination of the cordyceps militaris extract(CME) and dexamethasone(Dex).
中国论文网lD|3[;aQ t M:q c(U,i Q0METHODS: CNV model was induced by alkaline burn of the cornea with 1mol/L NaOH. Forty?
7K K7t+mm#b]7G'M0中国论文网a}E W%c dkz-Weight rats were divided into three groups randomly after modeling, A was model group, B
中国论文网%z5KUD b7m S3D*of中国论文网Z5s o"MW^pwas CME treatment group, and C was combination treatment group. All groups received
_] oAj|0&CRBy]h gl-j0medication by subconjunctival injection every other day after alkaline burn, group A
中国论文网4T
R T*Nb}#o)a |(A&AQ0received saline, group B received 10mg CME, group C also received 10mg CME, and received
{
t(J.NH"i0中国论文网 P:p%m sw E J
X&U8Fz0.25g/L Dex eyedrops three times each day, each injection volume was set at 0.1mL. On the
中国论文网#RZ)ft'R职称论文发表网 中国论文网 EF:R/CU7Z:z4, 8, 14 days, CNV was observed, and the expression of vascular endothelial growth factor
中国论文网O
T8Fo8J6JH{ rf\
];Q Cv)x^#FL0(VEGF) and it?s mRNA in the cornea were detected.?RESULTS: After modeling, rat CNV of
j7P%d d F^U(\ e0中国论文网,^)GkiZ:Lthe combination group was significantly reduced than the model control group and CME
xt/R!s/xa0h2r0Su/l)N+sB V Z0treatment group, the differences were statistically significant (P<0.05).CONCLUSION:CME
中国论文网pF E(|
^8K&gy#m.g(U0}hH%] vo,}(_
f0combining with Dex can inhibit alkaline burn?induced CNV growth more effectively.
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d#[9]4k x.Cl0 KEYWORDS: cordyceps militaris extract; dexamethasone; corneal neovascularizition;
A,_Z{;|v7U~b"|0
D`.V[2ct8vUvs0vascular endothelial growth factor
中国论文网.B(Z(B"SG
aTK aQ!tgn'Jq+O0 0 引言
w z[ @v$}0 ge9ZG4soa,egw0 角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV) 是常见的致盲性眼病之一,也是角膜移植术后
#h`)V4O0Bp0中国论文网!uy6o{&g发生排斥反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上的主要治疗手段,但其易诱发角膜穿孔、
| c-{b$dGS2X0中国论文网5f3}'M0D1IF青光眼、白内障等严重并发症，因而寻找安全有效的治疗CNV的药物一直是眼表研究的热点。蛹虫草主
p yD4HO4G,O9V04T/@p\#y I N/`0要用于抗肿瘤和增强免疫等治疗，近来国外有报道其有抗新生血管生成的作用，但尚未见有抗眼部新生
中国论文网0JM#V%K(Vp"}j)l&eQ2x*aM
|-m0血管的报道。我们的前期研究已证实，蛹虫草提取物（cordyceps militaris extract,CME）对大鼠CNV
#hL!h/t'V ka0'Z8lp b#`x0具有抑制作用，其高剂量与0.5g/L地塞米松(dexamethasone，Dex)的抑制作用相当。我们将 CME与Dex
i ^/lJ]"k Y0中国论文网@ b.M6cdD)PM8s联合用药，观察对大鼠CNV的抑制作用。
9O0G
B&Tw |N!|p0|0中国论文网"@ `#B+k!j8]+t8e 1 材料和方法
)LgD2p scCn z;q"CFe0)fM o3g
z ^0 1.1 材料
中国论文网5B
F#G5Lb中国论文网9P+P] K2|4e oB*{/HT 蛹虫草子实体，购自广东冬草堂虫草有限公司；0.25g/L Dex滴眼液，购自湖北潜江制药有限责任
4g&K0z? ` k0)?3A&OUwC4C0公司。清洁级健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠48只(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供) ,
3\v FN
c+c}*z0 o]U#b3w0`L$W!z0体质量220～250g。CME的制备采用水热回流提取法[1]：取蛹虫草子实体粉末50g，加10倍量的蒸馏水（
J)H9m6K {0职称论文发表网 中国论文网F+^C-iU500mL）于80℃热回流提取3 次，每次90min。合并滤液，减压浓缩，真空干燥器内干燥至粉末，4℃保
4y-U[ np l Z$Z0中国论文网Kd^&}j存备用。0.25g/L Dex滴眼液，采用潜江制药公司生产的滴眼液原液。图1大鼠碱烧伤后14d CNV生长情
中国论文网1}O?"k2q8Ym中国论文网$D2Kx&t:ac _&zx D况 A：模型对照组；B：CME治疗组；C：CME+Dex治疗组。
's|,B Onf O+A0n7}u[.A |`0 1.2 方法
中国论文网4akK9|,Z7a2\1R(es0Y.i4Y9t)cz0 采用100g/L水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，所有实验大鼠均选择右眼，裂隙灯下检查眼前节无病变
/`U!q5k
X:N0中国论文网q(R(VCzBE|6z。10g/L地卡因眼液表面麻醉，将统一规格直径3.0mm的单层圆形滤纸浸入浓度为1mol/L氢氧化钠溶液
$zv.e'aB&u!wK4y*Lm0中国论文网'[E;{3fKS20s，吸干滤纸上残余溶液后将其准确贴附于右眼角膜中央表面40s，取下滤纸后立即用生理盐水冲洗
中国论文网T
w t(c.q"_2L5M,Q}'T中国论文网vA0j2F*p.M3Iw0?4R#_2min。烧伤术后即观察大鼠右眼角膜，烧灼区域呈灰白色混浊，依据评分标准[2]确认中度碱烧伤模型
中国论文网s Cm2~$j&B%_5Ra h中国论文网 Nu X;p$?L建立。术后术眼点红霉素眼膏预防感染。抽签法随机将大鼠分成A,B,C 3组（A组:模型对照组；B组：
}bLB'Mj2x0中国论文网1} Q fSXUCME治疗组；C组：CME+Dex治疗组），每组15只。A组给予生理盐水0.1mL球结膜下注射。B组给予CME
中国论文网ac,m:n:vIm+J8a%k中国论文网zw1|#Y T#B10mg经无菌注射用水稀释为0.1mL后行球结膜下注射。C组给予CME 10mg球结膜下注射，另给予0.25g/L
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d9}G0中国论文网6A#b0t3`;vC Q Y8y6mzSDex滴眼液点眼，3次/d。每组均自术日起隔日球结膜下注射，给药至处死取材为止。于术后第4,8,14d
中国论文网r;F4a zL+y.Z2Bm'O0采用过量麻醉法处死大鼠,每次6只,迅速摘除眼球,在显微镜下剪下带1mm宽巩膜的角膜组织,平分为二，
RWI2p G|0&b9PnW
E'q)q9]0均置于?80℃低温冰箱备用，一份用于real time PCR检测VEGF基因水平的表达，另一份用于ELISA检测
中国论文网W\Tg2opS中国论文网@Yh V+u |*M? OVEGF蛋白水平的表达。
中国论文网8s8L0rU n(C%k;p*r|5~&` z0 1.2.1 CNV的定量分析
中国论文网:|l/I'P(t.p Y9T iG中国论文网#V]YI2g8\l h 角膜烧伤后各时间点行裂隙灯显微镜检查，测量新生血管长入角膜的长度及累及角膜圆周的钟点数
N,X7n:j&iC,w0中国论文网 S.M pJq$A，计算其面积。新生血管面积计算依据Robert公式[3]:S=C/12×3.1416[r2? (r?l)2],其中C代表新生
s0HV!`%x'M^0中国论文网RJj!f z n;o)s I血管累及角膜圆周的钟点数, l代表新生血管的长度（在显微镜下用游标卡尺测量，测量生长较长、弯
6n4BB KAh*KFV3b(x0中国论文网ri xu5D"U-Z'E曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管）, r代表角膜半径。
,E5PX J
?ue]0 1.2.2 角膜VEGFmRNA表达的检测
职称论文发表网 中国论文网@4V.P {g#mA!B B"p_4p's,T l0 角膜总RNA提取参照Trizol说明书(大连宝生物公司)，对保存在?80℃冰箱中的角膜组织总RNA进行
中国论文网8[y%j c"Fdu*k中国论文网d7J(mV
F Y%P9R提取与纯化,然后逆转录为 cDNA。Real time PCR 按照试剂盒(大连宝生物公司)说明书进行操作,采用
0U_K'o X LK0中国论文网4k:wf$N7?#fB5zNj25μL反应体系,以β?actin 为内参照。PCR反应条件: 95℃预变性30s, 95℃5s, 60℃ 30s,循环40次
&^p1B{(w2@0中国论文网8~2i,lzC7iM^。每例样本均设3个平行复孔，取均值。VEGF和β?actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。VEGF上
$? A HPxz0中国论文网8S,U$R0jZBx游引物: 5?GTCCTCACTTGGATCCCGACA?3?, 下游引物: 5??CCTGGCAGGCAAACAGACTTC?3?,扩增片断
F S9t(@ o.n2F0*eG }}._C]t&I0为99bp;β?actin上游引物: 5??GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3?,下游引物: 5??
中国论文网"kf UV1r Xpuh;\中国论文网5|$Eh0P U*`GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3?,扩增片断为150bp。
^*H'c w2\:D!W2p0 P u.g1e*IP0 1.2.3 角膜VEGF表达的检测
&P;H \!Z;X5[ r h(h0#o+m8_R1Bo)C0 经电子天平称量，所有标本每个定量为0.005g。将标本放入研钵，加0.01mol/L PBS缓冲液100μL
中国论文网"? |0u4z6wbLic中国论文网4zO^kN.` ckS3N研磨匀浆，使之呈现混悬液状，装入EP管，4℃ 5000r/min离心10min，收集上清液，?80℃冷冻保存，
#I V"X't C0'y8J3u TI$fR0夹心法ELISA检测。
中国论文网R I)J;n-dU _ m/d ;e:b^l0h0 统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，总体均数间比较采用单因素方差分析
T d3I0ty:z,@T4A6_9d0中国论文网1xHvn _/jW ofH8i6S yA，各组均数间两两比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义。
5Y R1?/L gzh9L0中国论文网-gJ-s jxs k
q0L 2 结果
G&R7W k~1{U&e0u+~3LN z(m#Ro7t0 2.1 CNV生长面积
中国论文网"L`
W6|dG y O3i `+h(RA4Y/uji0 模型对照组于角膜烧伤后3d开始长入新生血管，CME组与联合用药组于烧伤后4d开始长入新生血管
中国论文网 K;|TJ}C @中国论文网g aT&m'` \
p，均于8d左右生长速度达高峰，其后生长变缓，到两周时部分CNV开始消退(图1)。在烧伤后4,8,14dCME
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[(g&\0中国论文网v2Jo)j%g]
r治疗组与联合治疗组CNV面积均小于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），联合治疗组与CME治
中国论文网Z;B+m`#hGB!]eC}Lm @+q\e0疗组比较，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。统计结果显示，联合治疗组更能明显抑制CNV的生长(表
8X(r+b9S(K$B0中国论文网f&P%F@ GKF6A6cZ1)。表1大鼠CNV面积和VEGF表达水平（略）
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@5{a2rX&j6y@0p Yk UC4Hww0 2.2 角膜VEGFmRNA的表达
中国论文网[
~#d[ x中国论文网5J,a c@ uc*d(T 烧伤后B，C组mRNA的表达明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B，C组之间差异亦
中国论文网)C*O$[ Y ud5^+|3k%E+B\E V+KF[0具有统计学意义 (P<0.05，表1)。
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b _:A p b I gs0中国论文网/] n ^ r6yq f T @ 2.3 角膜VEGF的表达
中国论文网Z/?!v WP v1iG"\^4i8^#r0 在各时间点联合用药组较模型对照组及CME组均低表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，表1)，这
j Ms F X)h K7J4j03Wy*[+v)Y2Bz}s0与VEGFmRNA表达水平具有一致性。
D Xl8bb@lk$[0 Tmw_/{D2BG.q0 3 讨论
中国论文网 m1B h0I[ x4`&y&F-g中国论文网T:H"Dq4X2C8X[ p CNV属于难治性角膜疾病之一，常常导致患者视力下降，严重者可致失明。蛹虫草是一种名贵的中
/r Vp![ A2E4z3S0中国论文网y2Aj\ }
S@药材，其应用于临床有悠久的历史。近年来的研究显示，蛹虫草具有抗癌、调节免疫、抗理作用[4?6]
中国论文网pbW_jg7B,ci8y7} |~0。最近国外的研究显示，CME能够抑制新生血管的发生，它能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 [7]和鸡胚
中国论文网/S4](k)?U"g~I中国论文网 e"z2F-h nL绒毛尿囊膜的血管生成[8]。我们前期的研究显示，CME能够有效抑制碱烧伤所致的大鼠CNV的生长，高
(p2eA)?%n5I]0职称论文发表网 中国论文网 k7f Fbd4g6r;e剂量抑制作用与0.5g/L的Dex 相当。我们仍然采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型，联合运用CME及Dex，观
中国论文网
t3u)`;x+Q:f-YQ gw0h&c"I"w0察联合用药对CNV生长的抑制作用及其副作用的大小。实验结果显示，联合用药比CME单独用药更能有效
r
U4F.`0e u L%w R Y[0!KcT5p?'| @ h!f0抑制大鼠CNV的生长，且副作用不明显。这就提示，如能将蛹虫草开发成有效的抑制新生血管的药物，
/kl`w|9{/Ry0中国论文网 XuM(^z-jr Aj在治疗上辅以低浓度的糖皮质激素，可以明显提高治疗效果且有效降低副作用，从而为CNV的药物治疗
中国论文网!p&T I*r*O x2td~5i
Ot0提供新的思路。
e!j4C8| i r0l:W)} ~3XP5i1Z0【参考文献】
中国论文网;g"W \ago[~8BL'P 1 王英娟,李多伟,王义潮,等.蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究.西北植物学报2005
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