【摘要】 目的 研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特性，为治疗高尿酸血症相关疾病药物做基础研究。方法 用相对分子量5 kD,活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰，采用常规酶学分析方法，分别研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数，并比较修饰前后对抑制剂黄嘌呤的敏感性、最适温度、最适pH值、37℃时的稳定性以及在体半衰期等方面的差异。结果 经PEG修饰后尿酸酶最适温度由30℃升为35℃，最适pH无改变仍为pH8.7；在37℃水浴下,24 h后活性保留由40%增至70%，酶稳定性提高，体内半衰期由45 min延长至11 h；测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的Km分别为32.40、36.34 μmol/L，黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数分别为4.72、11.30 μmol/L。结论 假丝酵母尿酸酶经PEG 5 kD修饰后有药用潜力。
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Y E2HG0【关键词】 高尿酸血症；尿酸酶；PEG修饰；稳定性
_J+R ^&B09K6A o+Tc5y4q0 【Abstract】 Objective To research the basic characteristics of natural uricase and PEG?uricase, prepare PEG?uricase, modify the Candida uricase with PEG?5000 to improve the stability of the Candida uricase and extend the half?life of uricase in vivo.Methods PEG(relative molecular weight 5 kD, activation group for the NHS Asian ammonia) was used as a pecial modifier to modify uricase. With the conventional enzymatic analysis, some kinetic parameters of natural uricase and PEG?uricase were studied, and compared the differences of the sensitivity of the inhibitor of xanth, optimum temperature, optimum pH, the stability at 37℃ and the half?life in vivo before and after modification. Results It was demonstrated that after
&byo*rS Y-m0 PEG modification the optimal temperature of the uricase was upgraded from 30℃ to 35℃,the optimum pH was still 8.7 with no changing .37 ℃ water bath,24 h post?active retention increased from 40% to 70%, the enzyme stability was improved, the half?time in vivo extended from 45 min to 90 min.The Km of uricase and PEG?uricase were 32.40 and 36.34 μmol/L, the inhibition constants of xanthine on uricase and PEG?uricase were 4.72, 11.30 μmol/L. Conclusions PEG?modified uricase from the Candida utilis is promising to be a bio?drug for treating hyperuricemia.
I^o ]} PN C MG0 中国论文网2V,u `@V)x u 【Key words】 Hyperuricemia；Uricase；Pegylation；Stability
^+O:A g/l5V f:Ut0 中国论文网 c4h+b/`!h]N)H 尿酸为嘌呤分解终产物并主要通过肾脏排泄，血清尿酸水平是肾脏功能监测的有效指标。尿酸酶（uricase,EC1.7.3.3)专一催化氧化尿酸生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢，广泛用于临床检验领域测定血清尿酸。人体内缺乏尿酸酶时血清尿酸过高，易造成高尿酸血症，是心血管疾病、痛风等的主要诱因〔1，2〕。细菌、假丝酵母菌等微生物〔3～6〕及多数植物和低等动物都有活性尿酸酶。多数尿酸酶最适pH在8.5以上，但人体血浆pH接近7.4，在血浆中有较高比活性的尿酸酶才是理想的药用尿酸酶〔7〕。真菌尿酸酶在人体血浆中能保留较高的比活性，是理想的药用尿酸酶来源〔8〕，很早就有人尝试用假丝酵母尿酸酶治疗高尿酸血症，但至今没有成功开发出治疗高尿酸血症的药物蛋白。本文用相对分子量为5 kD、活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂，对产朊假丝酵母菌所产的尿酸酶进行修饰，以提高产朊假丝酵母尿酸酶的稳定性，延长在体半衰期，为药用尿酸酶奠定基础。
,n+l2J/g!~0研究生如何发表论文 中国论文网+to'Z r#m ms6Gy9s 1 资料与方法
中国论文网'B[:gs"U"x Zb!QG:]T.n.D;H O0o0 1.1 材料与试剂
中国论文网4egC;o [*F中国论文网Z a)|f5g Jd 假丝酵母菌（C.G.M.C.C.2.1008）来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，尿酸来自Alfa Aesar,黄嘌呤来自Avocado，DEAE?cellulose 52来自Whatma。其他试剂为国产分析纯。
中国论文网\e C0N5e中国论文网t7Ku*N)_:aHP 1.2 尿酸酶的制备及纯化
中国论文网@(gS H7V m(g |H TT0Xk
j7\,e_'Cyc0 挑菌落接入麦芽浸膏培养基（麦芽浸膏3.0%，pH6.7），28℃，240 r/min振荡培养24 h；再与诱导培养基(葡萄糖5%,尿酸0.06%,K2HPO4 0.2%,MgSO4 0.05%,pH6.7)中〔10〕，28℃，240 r/min振荡培养5～6 h；在4℃ 4 000 r/min离心20 min收集菌体，用0.05 mol/L硼酸缓冲液pH8.0悬浮菌体；在4℃下用MSE?超声仪，间隔10 s碎菌10 s，持续40 min；10 000 r/min离心15 min收集上清，30%～90%硫酸铵4℃将粗酶液分级；10 000 r/min离心收集沉淀，0.05 mol/L硼酸缓冲液4℃透析过夜；再将透析后的上清液过DEAE?cellulose52纤维柱，收集酶活性部分。
*?C;Y+d1v"ev0中国论文网pf;H4@ Zv)ehh 1.3 PEG化尿酸酶的制备
中国论文网[yM.VW!^A b I[研究生如何发表论文 中国论文网4a:e
P'WM/]$` j 标定透析后尿酸酶的浓度与活性，取20 ml 0.2～0.3 mg/ml的尿酸酶与PEG?5000以摩尔比1∶200比例混合，于4℃混匀1 h。
中国论文网6E$dPQ*YV:[1s(p^0x0 1.4 尿酸酶与PEG化尿酸酶的活力测定和表征
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Nsc _-{9H中国论文网2S z.An[8LP 1.4.1 酶活力测定
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k;dLP,j)c*_ Oa 反应体系1.2 ml，含1.156 ml硼酸盐缓冲液，溶解在二甲基亚砜3.75、尿酸0.024和0.050酶液样品中，在25℃条件下测定酶作用下293 nm吸收变化初速度（延迟30 s后共记录1.0 min），每分钟氧化1.0 μmol尿酸的酶量为1个单位。
中国论文网
v @utnEIf6|Yt中国论文网 Kj,IZ8`9E1Z e 1.4.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶米氏常数的测定
中国论文网%c*Mh}+X$@ Im中国论文网 @4W;DRx"Db 用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃条件下测定10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L终浓度尿酸下的初速度，用Lineweaver?Burk plot法回归分析初速度对底物浓度的影响以测定动力学参数。
中国论文网{;tH2B)z/Gfv!^T中国论文网Hr_j,G1V1h 1.4.3 黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数的测定
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x"}0 用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃测定黄嘌呤抑制作用，即回归动力学参数随着抑制剂浓度的变化，从而确定抑制类型和对应抑制常数。
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Z}$i 1.4.4 最适pH测定
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J3H-jd|5X,R0 将测酶活性缓冲液及尿酸配成pH7.2～9.0硼酸?硼砂缓冲液，将酶分别预先加入缓冲液中25℃孵育1 h，将尿酸同样放在25℃温浴1 h，将二者混匀，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性，以pH为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。
中国论文网r{+L8LM"p5zM)BS ]1@f+a@+aZ5A0 1.4.5 最适温度的测定
中国论文网oxU:fnV V v p中国论文网7Y5g&V \$N 将待测的酶缓冲液和尿酸分别放置在5℃，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃中，将酶预先放置在0℃，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以温度为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。
中国论文网 D |8iy l$aA?5I/D#D@c~ w0 1.4.6 尿酸酶与PEG化尿酸酶在37℃时的稳定性测定
中国论文网8NO6s$vqWUF xt/`}+a8G0 将待测酶液放入37℃水浴温育，分别在1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、24、27、33、48 h按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以时间为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。
,uQ0}+q5p M A%_`0KA01.4.7 尿酸酶与PEG化尿酸酶在体半衰期测定
中国论文网!y@I&U\NLJ!KrB9\:P O!F ~0 雄性大鼠10只，尾静脉注射尿酸酶每只1 U，在5、10、20、40、60 min及2、4、6、8 h时眼球取血，3 600 r/min 离心10 min，取上清,冷冻备用。25℃温浴缓冲液，将血清预先放置在25℃，按测定尿酸酶活性的方法测定血浆中尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以时间为横坐标，以血浆中尿酸酶与PEG化尿酸酶的活性为纵坐标作图。
研究生如何发表论文
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Q{l%k%v*V0中国论文网&?R4M wN!C%M&p/AT$f J 1.4.8 实验组离体多次降尿酸实验评价尿酸酶的药效
s u;G:e1S09S3sz.k)z9_X#^.?7K0 取大白兔(n=2)静脉血液约80 ml，离心获得血浆约20 ml。用20 ml血浆模拟体内环境，分装于5个5 ml管中，加入一定的尿酸和黄嘌呤抑制剂，标定尿酸与黄嘌呤浓度（尿酸终浓度为800 μmol/L，黄嘌呤总浓度为300 μmol/L）。混匀后各吸取给药前的血浆作为对照组，然后置于37℃烘箱中，待温度稳定后加入尿酸酶0.02 U/ml，摇匀后分别在5、15、30、45、60、90、120、135、140、160、180、200、230、255、280、300、330、 360 min时取样，分别在120、240 min时在原体系中继续加入700 μmol/L尿酸，600 μmol/L，分析血浆中尿酸的变化值。
)D:R&K&})`/x;]04Agr7s%qjHwf0 2 结果
[Rs| I6j9HB/[0中国论文网`$h:t.vFC.W(od/{ 2.1 PEG化尿酸酶与天然尿酸酶SDS?PAGE电泳图 见图1。
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_8@T0 中国论文网@bN PW&n 2.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特征
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p5`b0B/|+|%\y` 2.2.1 尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数
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u0 在（25±0.5）℃且pH8.8时，天然尿酸酶米氏常数(K)为32.40 μmol/L，黄嘌呤不改变其最大反应速度，但使其K显著升高，对应抑制常数为4.72 μmol/L。同理测得PEG化尿酸酶K为36.34 μmol/L，对应抑制常数为11.30 μmol/L。见图2。
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F0 2.2.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶的其他基本特征
研究生如何发表论文 中国论文网7O
[&n n,{)J/EMVK.EE.s1ct)`W,H0 尿酸酶与PEG化尿酸酶的最适pH同为8.7，在pH7.4时PEG化尿酸酶保留活性优于天然尿酸酶。天然尿酸酶的最适温度为30℃，PEG化尿酸酶的最适温度为35℃，当温度超过50℃，两者活性下降很快。PEG化尿酸酶在37℃时的稳定性明显优于天然尿酸酶。天然尿酸酶在大鼠体内半衰期是 15 min左右，经PEG修饰后尿酸酶在体半衰期延长至11 h。见图3。
qI$? y V\7^0F6C5EZ*D0 2.3 尿酸酶与PEG化尿酸酶离体模型评价尿酸酶的药效
[g U8s HA00@-~ x2\1e F#Y0 可以看到持续3轮，尿酸酶均将尿酸降至正常水平。故此尿酸酶可用于高尿酸血症的降尿酸药物。见图4。
中国论文网{8e!nS He\uv:^1^中国论文网+RH1li1kX.{/h"q 3 讨论
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GX )H:kb
nfO&@:WC+r0 产朊假丝酵母菌在以尿酸为氮源时才表达尿酸酶，本文所用诱导培养基也可诱导表达尿酸酶，用0.05 mol/L硼酸缓冲液(pH8.0)平衡的DEAE?cellulose52柱层析纯化该酶时，酶蛋白不吸附，表明此菌株产生的胞内蛋白和尿酸酶主要是碱性蛋白，这与文献报道的假丝酵母尿酸酶明显不同〔6〕。通过对此尿酸酶的表征测定发现，此尿酸酶在生理pH下保留50%左右的酶活性；37℃稳定性很好，对尿酸亲和力高。因此，此尿酸酶有药用潜力。本实验用相对分子量为5 kD,活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰，修饰后保留65%的酶活性，与文献报道活性下降88%不同〔8〕。经PEG修饰后尿酸酶最适pH无改变，仍为8.7。有研究表明pH8.5的尿酸酶非常适合于临床应用〔9～11〕，最适温度由30℃升至35℃，接近人体体温。并且在体半衰期由40 min延长至90 min，因此经PEG 5 kD修饰后的尿酸酶较天然尿酸酶的药用潜力更大。通过定点突变改造有望降低其对黄嘌呤抑制作用的敏感性，延长在体半衰期，使得此酶的突变体有望成为药用蛋白。此工作目前正在进行中。
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