【摘要】 目的：观察损伤坐骨神经周围注射可乐定对慢性坐骨神经结扎模型(chronic constriction injury，CCI)大鼠促炎性细胞因子表达的影响，探讨α2-肾上腺素受体激动剂是否对已经形成的神经病理性疼痛产生作用。方法：雄性SD大鼠32 只，随机分为4组，每组8只。Sham组：只分离皮肤、肌肉，不结扎坐骨神经;Sal组：形成CCI后注射生理盐水组;Clo组：形成CCI后注射可乐定组;Clo+Yo组：形成CCI后注射可乐定和育亨宾组。在注射药物3 d后急性处死动物，取患侧脊髓L4、L5、L6背根神经节采取全自动化学发光法检测TNF-α和IL-6浓度。结果：术后从7 d开始CCI大鼠脊髓背根神经节TNF-α和IL-6浓度有明显增高。损伤坐骨神经周围注射可乐定能明显抑制CCI引起的脊髓背根神经节TNF-α和 IL-6的表达(P<0.01)。结论：损伤的坐骨神经周围注射可乐定可以降低促炎性细胞因子的表达。
快速发表论文 中国论文网-]9K9r S r&p&W-M cf4|k0【关键词】 可乐定;外周注射;CCI大鼠;神经病理性疼痛;TNF-α;IL-6
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ZAY5P+NS8p Abstract Objictive: To assess the effect of perineural clonidine on the expression of TNF-α and IL-6 in the rats with chronic constriction injury(CCI) in the sciatic nerve. Methods：Thirty-two male SD rats were randomly divided into four groups(18 for each):sham group, Sal group (CCI+ saline), Clo group(CCI+clonidine) and Clo+Yo group(CCI+clonidine+ yohimbin). The rats were killed 3 days after the injection of medicine mentioned above and spinal cord DRG of L4,L5,L6 were taken for determining the concentration of TNF-α and IL-6 of DRG in the rats with automatic luminescent technique. Results: The rats of CCI group demonstrated steady mechanical and heat hyperaglsia from the seventh day after the operation. There was a remarkable increase in the concentration of TNF-a and IL-6 in DRG from the 7th day after the operation. Perineural injection of clonidine could suppress the expression of TNF-α and IL-6 caused by CCI in the DRG of CCI rats(P<0.01). Conclusion: Perineural injection of clonidine modulates proinflammatory cytokines expression in CCI rats.
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W1U m-n Key words Clonidine; Perineural inject; CCI; Neuropathic pain; TNF-α; IL-6
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r ZXE01Q9q5Mm ]*U0 神经病理性疼痛(neuropathic pain)是指由于神经系统受到损伤或产生病变而导致的疼痛。病理生理学特点主要表现为痛觉的高反应性,如痛觉过敏( hyperalgesia)、痛觉超敏(allodynia)及自发疼痛( spontaneous pain)等。神经病理性疼痛不同于由于组织损伤而导致的急性疼痛,通常呈慢性，可持续数天或数月,是目前临床治疗的难点之一。可乐定( clonidine)是α2-肾上腺素受体激动剂,临床上常用来治疗高血压。近年来发现它具有很好的缓解神经病理性疼痛的作用，多用于鞘内、静脉注射或伍用其他药物治疗慢性疼痛。本实验拟在经典的神经病理性疼痛模型CCI上，通过在结扎坐骨神经产生痛敏后，在损伤神经周围注射可乐定，探索外周注射可乐定是否对已经形成的疼痛产生影响,并通过检测促炎性细胞因子变化探索其可能参与的作用机制。
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l 1 材料与方法
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@U X#r0 1.1 材料 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,体重(200±20) g，由广东医学实验动物中心提供。动物置于(20±1) ℃和24 h昼夜循环的环境中，能够自由地获取水和食物。所有动物适应环境3 d后投入实验。盐酸可乐定注射液(035K0846)、盐酸育亨宾注射液(015K1444)以及TNF-α、IL-6试剂盒均购自美国Sigma公司。
s$Sq \|+U,~0中国论文网,tw~ B J#b-^9V(tL 1.2 方法
Fc0i o)T07kGJ8bB+yTh^0 1.2.1 动物分组 随机将32只大鼠分为4组,每组8只。Sham组：只分离皮肤、肌肉，不结扎坐骨神经;Sal组：坐骨神经结扎后7 d注射生理盐水;Clo组：坐骨神经结扎后7 d注射可乐定组;Clo+Yo组：坐骨神经结扎后7 d注射可乐定和育亨宾组。
6~9g0a0R.z2o0中国论文网6kza0^S-z7ubI[ 1.2.2 CCI模型的建立 依照Bennet方法，大鼠腹腔注射10 %水合氯醛 (50 mg/kg)麻醉后，在一侧后肢剪毛消毒,在股骨外侧纵形切开皮肤,顺肌纹钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织,用3.0丝线结扎坐骨神经中段,使神经外膜轻度凹陷,但不阻断血供,缝合皮肤。假手术组只钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织，不结扎坐骨神经。术后7 d以MWT和TWL较基础痛阈下降40 %以上者视为CCI模型成功，投入实验。
1^nN"\'x#[0中国论文网8q"isHy4f7o&d1wj:n 1.2.3 注射药物操作 CCI术后7 d，完成行为学测定后，水合氯醛麻醉动物。分别将1 mL生理盐水、1 mL盐酸可乐定注射液(150 μg/kg)和1 mL盐酸可乐定注射液(150 μg/kg)、盐酸育亨宾注射液(220 μg/kg)和生理盐水混合液吸入1 mL注射器。依照先前文献所示实验方法，在大鼠的大转子和坐骨结节间皮肤进针，然后向前内侧前进，沿坐骨神经走行扇形注射药液。在预试验中注射大鼠相同剂量的2 %利多卡因会使95 %受试大鼠产生短暂的单侧肢体麻木，证实药物注射在神经周围且发挥作用。
1B-Uv8W*I0快速发表论文 中国论文网H2U(R8JI 1.2.4 TNF-α和IL-6的测定 32只动物在注射药物3 d后，完成最后行为学测试，使用10 %水合氯醛麻醉动物，断头宰杀。收集4组每个动物患侧的L4、L5、L6的背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)。所有样本都被收集到1.5 mL的聚丙烯试管(无热源、经DNΑ酶和RNΑ酶处理)，称重后立即放入干冰，随后所有收集的组织都以-80 ℃温度保存以待分析。以每毫克组织10 μL的比率加入正常细胞培养液和10 %灭活的牛血清，在冰浴中以超声匀浆器匀浆。然后以1 300×g速度离心，持续15 min，温度为4 ℃。取上清液继续保持4 ℃，1 500×g速度离心10 min。取上清液采用全自动化学发光法，使用全自动化学发光免疫分析仪对上清液进行TNF-α、IL-6含量测定。具体操作分别按TNF-α试剂盒和 IL-6试剂盒说明进行。重复测定2次，取其均值作为最后结果。
中国论文网 I mO4U7Rye,k`A中国论文网i$I"J,R{W 1.2.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，两组均数间的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
中国论文网v*k W?Be.J_J7U中国论文网Hohn,a&F$f 2 结果
中国论文网 O]pk~8rhUMkx1_ ]0 2.1 动物模型行为表现 实验期间，所有大鼠均保持良好状态，无明显伤口感染现象。Sham组大鼠活动如常。结扎坐骨神经大鼠左侧(结扎侧)出现舔爪、跛行，安静时患足常保持防御姿势。患侧足趾并拢并呈轻度外翻状。注射可乐定后，舔爪、跛行等行为减轻。
9MR-x0P? eI O a(m0u^"ENI0 2.2 促炎性细胞因子变化
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v0 2.2.1 TNF-α的变化 与Sham组相比，注射药物3 d后， Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节TNF-α浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。Clo组大鼠背跟神经节TNF-α浓度升高不明显，和Sal组、Clo+Yo组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
%p ]#bn$O0中国论文网4|'r"UX,ci Gj 2.2.2 IL-6的变化 与Sham组相比，注射药物3 d后，Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节IL-6浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01);Clo组大鼠背跟神经节IL-6浓度升高不明显，和Sal组、Clo+Yo组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。表1 促炎性细胞因子表达
中国论文网 P"zh^(~快速发表论文 { ` C4\4z%I3_0 3 讨论
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zy_0Zs i6F t)Z V c0 3.1 神经病理性疼痛模型 对神经病理性疼痛发病机制的研究大多来源于动物模型。Bennett和Xie等开发出的CCI模型与临床神经病理性疼痛特征有相似之处，制作过程相对简单而可靠，得到疼痛学界的广泛应用。该模型通过对坐骨神经松弛环扎，产生痛反应。可成功模拟神经病理性疼痛典型的自发痛、痛觉过敏和诱发痛等症状并能维持一段时间。CCI模型损伤区域近端神经纤维正常，无显著DRG细胞死亡证据。
中国论文网Ti*B v\ M3.2 促炎性细胞因子和疼痛的关系 TNF-α是一类促炎性细胞因子，由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，是其它促炎性细胞因子级联反应的始动因素，可以诱发其它IL-1、IL-6、IL-8等促炎性细胞因子的产生。在组织中TNF-α的水平和一些疼痛和痛觉过敏的程度有关[1,2]。皮下注射 TNF-α可以降低大鼠腓神经C-伤害感受器对机械刺激的激活阈值[3]。有研究发现，阻断TNF-α可使各种神经病理性疼痛模型大鼠或小鼠的痛觉增敏 [4-5]。神经损伤后，雪旺氏细胞也产生TNF-α，表明其与神经病理性疼痛有着密不可分的关系[6-7]。IL-6是另一种促炎性细胞因子，和神经病理性疼痛的形成和维持有极大关系[8]。激活的免疫细胞产生IL-6的过程和神经病理性疼痛有着密切联系。对于这点，早在1996年，DeLeo JA等[9]学者就对此做了相关的研究。他们制作成功坐骨神经冷冻大鼠模型(sciatic cryoneurolysis， SCN)后，使用免疫组化实验定位大鼠的脊索，显示在脊髓灰质和运动神经元IL-6的水平要高于正常对照大鼠。进一步实验又发现，在鞘内注射重组人IL- 6正常大鼠，对正常触觉会产生异常性疼痛。这样，有理由认为，降低TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子的产生可以改变慢性疼痛的发生和维持，对其产生的痛敏反应也会产生影响。
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b xP/{ V X"L0中国论文网O|(i0T~0Y\ 3.3 CCI术后促炎性细胞因子和α2-肾上腺素受体变化 坐骨神经结扎可以导致轴突损伤、局部炎症反应和华勒氏变性(Wallerian degeneration,WD)。神经束损伤后，首先活化神经内膜的成纤维细胞，产生部分趋化分子参与宿主防御反应。这些趋化分子使免疫细胞(主要是中性粒细胞和巨噬细胞)从循环中向神经聚集，产生促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、NO、活性氧类(ROS)等参与免疫反应[10]。同时成纤维细胞产生的这些物质也直接使神经兴奋、损伤神经髓质以及改变血-神经屏障,从而使神经水肿，继而使更多的免疫细胞、抗体等浸润，同时也改变临近神经纤维的结构和功能[11]。除了成纤维细胞，神经内膜一些驻留型的巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮样细胞也被活化，也释放部分TNF-α和IL- 6等促炎性细胞因子，以及NO、ROS等免疫细胞趋化因子。还有包绕在外周神经周围的雪旺氏细胞活化，同样也会释放TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子。TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子可使外周神经脱髓鞘以及变性，增加传入神经的兴奋性，产生神经病理性疼痛[12]。同时，TNF-α和IL-6 等促炎性因子使损伤外周神经产生炎性反应可释放P物质，而P物质可使免疫细胞释放促炎性因子，从而形成P物质-促炎性细胞因子正反馈环。二者相互作用，加剧疼痛的发展。还有学者发现，TNF-α和IL-6等促炎性因子也可以逆向转运到背根神经节，引起背根神经节的交感神经出芽，从而产生神经病理性疼痛[13]。所以我们有理由认为TNF-α和IL-6等促炎性因子是产生神经病理性疼痛的重要因素，同时也是痛信号向背角传递的重要介质之一。
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{8h 外周神经损伤可以导致损伤神经局部α2-肾上腺素受体增多，从而导致痛觉过敏以及疼痛[14]。坐骨神经结扎48 h后，在神经损伤部位可有α2-肾上腺素受体免疫反应性增强以及其和配体的结合增强[15-16]。对于神经损伤大鼠，注射去甲肾上腺素可以使30 %～50 %的C纤维兴奋[17]。但这种作用可以被α2-肾上腺素受体激动剂所阻滞。
kD7e!ZX]f d*Q0(k4g2DRb2S&G'` p5s0 3.4 外周注射可乐定对促炎性细胞因子的影响 大鼠施行CCI术后，BDG中TNF-α和IL-6的表达明显增高。患侧坐骨神经周围注射可乐定可使CCI大鼠BDG中TNF-α和IL-6的表达降低，育亨宾可以阻滞这种作用，这和外周注射可乐定减轻痛敏的作用相似。可以认为外周可乐定注射对 CCI大鼠BDG中TNF-α和IL-6表达的影响也与α2-肾上腺素受体有关。先前的研究发现，外周注射可乐定可发挥α2-肾上腺素受体作用使酵母多糖注射诱发神经炎性痛模型中T-淋巴细胞和单核/巨噬细胞调亡，从而减少了促炎性细胞因子表达。同时还认为α2-肾上腺素受体激动剂刺激神经微环境改变促炎细胞性因子细胞表型，使促炎性细胞因子表达减少[14]。此研究结果也和本实验的结果相同。
.o;QL7\{ D(b0 s2UJ M,z0 综上所述，外周注射可乐定通过作用于α2-肾上腺素受体发挥免疫调制作用，使诱发聚集在此的免疫细胞调亡，从而减少了促炎性细胞因子以及神经生长因子的产生。可乐定改变成纤维细胞、巨噬细胞、胶质细胞等免疫细胞释放TNF-α、IL-6等促炎性因子表型，减少促炎性细胞因子的产生，从而使促炎性细胞因子向中枢的传送减少，减轻中枢致敏，从而产生止痛作用。对于临床上常见的外科手术、肢体离断等并发的顽固性慢性疼痛，可以尝试以外周注射可乐定作为治疗的的选择。
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