环孢素A、维拉帕米、川芎嗪对胃癌多药耐药细胞株SGC-7901/ADR逆转作用的研究

【摘要】  目的：探讨环孢素A（CsA）、维拉帕米（VP）、川芎嗪（TMP）对胃癌多药耐药细胞株SGC-7901/ADR耐药性的逆转作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察SGC-7901/ADR对化疗药氟尿嘧啶（5-FU）的耐药性，选择CsA、VP、TMP的非细胞毒性剂量，并观察其与5- Fu联合对SGC-7901/ADR的逆转作用。结果：SGC-7901/ADR对化疗药5-FU具有耐药性，相对耐药性(RF)为97.49；CsA 3.0mg/L、VP 10.0mg/L、TMP 300.0mg/L以下为SGC-7901/ADR细胞的非细胞毒性剂量，除CsA外，VP和TMP对SGC-7901/ADR的逆转作用呈剂量依赖关系；300.0mg/L TMP较10.0mg/L VP逆转作用强（P<0.01），使SGC-7901/ADR相对耐药性降至12.89，将5-FU IC50由13.001mg/L下调到1.542mg/L，逆转倍数是8.43倍。结论：SGC-7901/ADR对5-FU具有耐药性，300.0mg /L TMP是SGC-7901/ADR细胞多药耐药性最有效的逆转剂。
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【关键词】  胃癌；多药耐药；SGC-7901/ADR细胞；逆转
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　　 Abstract  Objective: To investigate the reversal effect of Cyclosporin A (CsA), Verapamil (VP), and Tetramethylpyrazine (TMP) against the multi drug resistance (MDR) gastric cancer cell line SGC-7901/ADR. Methods: MTT assay was used to assess the sensitivity of SGC-7901/ADR cells to Fluorouracil (5-FU). CsA, VP, and TMP at non-toxic doses were separately applied together with 5-FU to examine potential reversal effect against SGC-7901/ADR cells by each agent. Results: SGC-7901/ADR cells are resistant to 5-FU with relative resistance (RF) of 97.49. The non-cytotoxic dose limits for CsA, VP, and TMP are 3.0 mg/L, 10.0 mg/L, and 300.0 mg/L respectively. Both VP and TMP but not CsA exert dose-dependent reversal effect against SGC-7901/ADR cells with TMP at 300.0 mg/L exerting stronger reversal effect comparing with VP at 10.0mg/L (P<0.01). At 300.0 mg/L, TMP reduces the RF of SGC-7901/ADR cells to the value of 12.89 and lowers the IC50 of 5-FU from 13.001 mg/L to 1.542 mg/L with a reversal fold of 8.43. Conclusion: Multi drug resistance cell line SGC-7901/ADR is resistant to 5-FU while TMP at 300.0 mg/l is the most effective reversal agent examined here against SGC-7901/ADR cells.
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6OQQ!pOS:? J0　　Key words  Gastric Cancer； Multi drug resistance (MDR)； SGC-7901/ADR cell； Reversal
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P6Q'JZ|3vu*G0　　化疗在胃癌综合治疗中发挥着重要作用，但往往因为肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性（multidrug resistance，MDR）而疗效不佳[1-2]。解决MDR主要方法：一是寻找对MDR肿瘤细胞有效的抗癌药物，二是通过增加细胞内化疗药物浓度而逆转MDR。本试验旨在通过体外试验观察逆转剂CsA、VP、TMP对SGC-7901/ADR细胞耐药性的逆转作用，为胃癌有效的化疗提供理论依据。
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　　1  材料与方法
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-Etz/JnHT YxV0　　1.1  人胃癌细胞系  人胃癌细胞株SGC-7901、耐阿霉素药细胞株SGC-7901/ADR均由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠。
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　　1.2  药物、试剂及主要仪器  TMP（北京永康药业有限公司），CsA（瑞士Sandoz公司），VP（上海禾丰制药有限公司），5-Fu（南通精华制药有限公司），阿霉素（ADM，汕头经济特区明治医药有限公司），RPMI1640（美国GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物研究所），MTT、DMSO、胰蛋白酶（美国Sigma公司），倒置显微镜（重庆光学仪器厂），酶标仪（美国Biotek公司）。
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CoH \/P/{u0　　1.3  方法
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　　1.3.1  细胞培养  将SGC-7901细胞置于10%新生小牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中。SGC-7901/ADR细胞置于含1.0μg/mL ADM的上述培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养。SGC-7901/ADR细胞实验两周前培养于不含ADM的培养液中。
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　　1.3.2  确定SGC-7901/ADR对5-FU的耐药性  采用MTT法，取对数生长期的SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞，以5×104密度接种于96孔板上，培养24小时。实验孔加入不同浓度的5-FU（10.0μg/L～105μg/L）（参照临床用量的血峰浓度设定实验药物浓度）。每浓度设5个平行孔，培养48小时，加入 20μL（5.0g/L）MTT，4小时后加入DMSO 150μL，摇床摇匀，以酶标仪490nm波长测定各孔吸光度（A值）。计算不同浓度下细胞的存活率[3][SR=（实验组A值/对照组A值）×100%]、半数抑制浓度IC50及相对耐药性[4](RF=耐药细胞株IC50/胃癌细胞株IC50)。
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　　1.3.3  确定CsA、VP、TMP的非细胞毒性剂量  方法同上，以SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞为靶细胞。设空白对照组、阴性对照组、CsA组(1.0mg/L、2.0mg/L、 3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L)、VP组(5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg /L)、TMP组(100.0mg/L、200.0mg/L、300.0mg/L、400.0mg/L、500.0mg/L)，计算细胞在不同药物浓度下的SR。
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S s6R2zh.mi7M"Ct0　　1.3.4  观察CsA、VP、TMP的逆转作用  采用MTT法，在SGC-7901细胞和SGC-7901/ADR细胞中加不同浓度5-FU(10.0μg/L～105μg/L）、不同浓度5- FU(10.0μg/L～105μg/L)+非细胞毒性剂量的“逆转剂”，计算药物的IC50及逆转倍数RI(RI=单独用药IC50/联合逆转剂后 IC50)。
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A-d#M4M$rk3GPL%i0　　1.3.5  统计学处理  采用SPSS11.5统计软件包进行回归分析、t检验及方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。中国论文网}\n$hg[k%J/x

yfu'PX&I d bq0　　2  结果中国论文网*VGgT u

2MPf(S.P;J0　　2.1  确定SGC-7901/ADR细胞对5-FU的耐药性  SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性，相对耐药性(RF)为97.49，见表1。
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rpl-~e2m'f1m0　　表1  不同细胞对5-FU IC50的影响（略）中国论文网)~XF`@{

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J0　　2.2  确定CsA、VP、TMP的非细胞毒性剂量  在MTT实验中，当SGC-7901/ADR细胞存活率SR≥95%[5]时，确定为本实验采用的非细胞毒性剂量，即CsA在3.0mg/L、VP在 10.0mg/L、TMP在300.0mg/L浓度以下。在此剂量范围内各种药物对SGC-7901细胞亦无明显细胞毒性作用，见表2、表3、表4。中国论文网qQyPD1G5~.R-b4~
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　　表2  CsA在不同浓度下对SGC-7901/ADR细胞存活率的影响（略）
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　　表3  VP在不同浓度下对SGC-7901/ADR细胞存活率的影响（略）
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)t:hgD6^~z;F0　　表4  TMP在不同浓度下对SGC-7901/ADR细胞存活率的影响（略）
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!K l7J|QtE0　　2.3  观察CsA、VP、TMP的逆转作用  在非细胞毒性剂量范围内，1.0～3.0mg/L CsA无逆转作用，VP和TMP对SGC-7901/ADR细胞的逆转作用呈剂量依赖关系（RVP=0.999，P=0.001；RTMP=0.972，P=0.001）。300.0mg/L TMP较10.0mg/L VP逆转作用强（P<0.01）。300.0mg/L TMP能显著增加SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性（P<0.01），而对SGC-7901细胞却无增敏作用（P>0.05），使耐药细胞相对耐药性降至12.89，5-FU IC50由13.001 mg/L下调到1.542mg/L，逆转倍数为8.43倍，是有效的逆转剂，见表5、表6、表7。中国论文网#c8Y"g9\7xft
表5  CsA对SGC-7901/ADR细胞耐药性的逆转作用（略）
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P@6b C8j M.T3U9x0　　*与5-FU组比较P>0.05中国论文网tV,uYB!x!l

zk Hr+N#e_1V&Ue0　　表6  VP对SGC-7901/ADR细胞耐药性的逆转作用（略）

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?f'i g{k0　　**与5-FU组比较P<0.01中国论文网 Iz VXWIq9W

:g/U"\wgZ_$W6y0　　表7  TMP对SGC-7901/ADR细胞耐药性的逆转作用（略）
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cB0　　**与5-FU组比较P<0.01；△与5-FU+VP10组比较P<0.01中国论文网)pv$q L4?5_uG

6rr[1r-[V s u0　　3  讨论
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k'm,Be G v:Y:b&bf0　　肿瘤产生MDR的主要机制是P糖蛋白（P glycoprotin，P-gp）及多药耐药性相关蛋白（multidrug resistence associated protein，MRP）的过表达[6]，引起药物外流及细胞内药物积蓄减少。胃癌多药耐药细胞系SGC-7901/ADR对阿霉素、长春新碱、丝裂霉素等多种药物具有耐药性[7]。本研究证实，SGC-7901/ADR细胞对5-FU同样具有耐药性，相对耐药性为97.49。
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9X+zVF5yJ4Z_Z0　　钙离子拮抗剂VP是第一个应用于临床的MDR逆转剂，可与细胞膜上的P-gp结合，有效逆转P-gp药物泵的作用，还可在mRNA水平上抑制P-gp合成及活性，使化疗药物在细胞内浓度升高，细胞毒效应增强[8]。本实验结果显示，5.0mg/L和10.0mg/L VP均可增加SGC-7901/ADR细胞对5-Fu的敏感性且呈剂量依赖关系。但在临床实践中，因其具有心脏毒性、神经毒性、骨髓抑制而限制了它的临床应用，故而逆转作用不能充分发挥。中国论文网sfyW8cQI
  
;W~E WuoJs&A0　　TMP为中药川芎的主要有效成分，属酰胺类生物碱，目前认为它是一种新型的钙离子拮抗剂[9]。近年来发现，TMP可通过多种途径对肿瘤起到治疗和辅助治疗的作用。本实验结果显示，100.0～300.0mg/L TMP能增加SGC-7901/ADR细胞对5-Fu的敏感性并呈剂量依赖关系，且300.0mg/L TMP对耐药细胞的逆转作用强于10.0mg/L VP（P<0.01）。根据体外实验抗癌药物疗效的评价标准[10]，将药物的IC50明显下调<10.0μg/mL,说明药物在体外的杀伤剂量，对体内实验研究有重要参考价值。TMP逆转机理可能通过多靶点发挥作用 [11]，机制包括：(1)具有钙拮抗作用并降低谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性；(2)影响多药耐药相关基因（MDR1）的表达及P-gp、 MRP、肺耐药相关蛋白（LRP）功能；(3)降低抗凋亡基因bcl-2与bcl-xl高表达等。中国论文网[N#eV5r8]2}/W4f$W
  
}-Wn8x6|ccV0　　CsA据报道也可逆转肿瘤多药耐药性，但在本实验中并不能增加SGC-7901/ADR细胞对5-Fu的敏感性，与Jette[12]和郭和清等[13]的实验结论一致。本实验出现的现象可能与CsA诱导P-gp表达有关。
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　　综上所述，体外实验证实TMP对SGC-7901/ADR细胞耐药性的逆转作用最强（P<0.01），且不良反应少，为胃癌的治疗提供重要依据。
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