【摘要】 目的：研究BRCA1抑癌基因的微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)和杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)与散发性大肠癌临床病理特性的相关性，阐明BRCA1基因遗传不稳定性与大肠癌发生、发展的关系。方法：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，对41例大肠癌标本及对应的正常组织进行BRCA1基因D17S579位点 MSI、LOH检测。结果：41例大肠癌D17S579位点MSI、LOH检出率分别为21.95 %、17.07 %;在肿瘤TNM分期中，D17S579位点MSI检出率在TNMⅠ+Ⅱ期为36.36 %，高于Ⅲ+Ⅳ期的5.26 %，二者差异有统计学意义(P<0.05);在D17S579位点，LOH与大肠癌的TNM分期有关，在大肠癌TNMⅢ+Ⅳ期为36.84 %，高于Ⅰ+Ⅱ期的0.00 %，二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论：散发性大肠癌BRCA1抑癌基因D17S579位点存在MSI和LOH，MSI和LOH通过不同的途径调控大肠癌的进展，BRCA1抑癌基因MSI可能在中国人散发性大肠癌早期阶段起作用，而LOH多发生在大肠癌晚期。
快速发表论文 Nd {)Y$B SxK$^)\H5k]0.LZY!gs$v R0【关键词】 大肠癌;BRCA1基因;微卫星不稳定性;杂合性缺失
H jN8w,U03rS e;[8]
jn$q0大肠癌包括直肠癌和结肠癌，是常见的恶性肿瘤，在西方发达国家其发病率居恶性肿瘤第2位。每年全球大约有100万的新发病例，有50万人死于结直肠癌。近年来，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，居恶性肿瘤发病第4位，而在经济发展快的地区，结直肠癌的发病率上升更为迅速，目前在北京、上海地区居恶性肿瘤第3位[1]。大肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,是机体的内因与环境的外因交互作用的结果。从分子水平研究恶性肿瘤发病机制是近十几年研究的热点之一。研究表明，恶性肿瘤的发生、发展与原癌基因的激活和抑癌基因的失活有密切关系，以后者更为重要[2]。而抑癌基因的遗传不稳定性，如基因的微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)和杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)则可能导致基因突变，则是影响肿瘤临床特性的重要因素[3]。国内对大肠癌BRCA1基因的MSI和LOH研究较少，本文采用PCR-SSCP结合银染的方法，检测了41例中国人散发性大肠癌中17q21 区域D17S579位点的MSI和LOH，揭示了其与大肠癌发生、发展等临床病理特性的关系，为结直肠癌临床治疗及分析预后提供实验研究依据，从而探讨大肠癌遗传不稳定的分子机制。
,]? M`VV%uc0快速发表论文 \(n,\6E$[ {iK n0 1 材料与方法
(xe:}F ^#o]9N0/cO(Y"{f9bP0 1.1 材料
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[A4e0中国论文网H2LI't F/D j 1.1.1 标本来源 41例大肠癌组织取自包头市第七医院2006 年10月至2008年10月期间手术切除的标本，均经病理检查诊断为大肠癌，其中男21例，女20例，年龄30～81岁，平均年龄61.8岁。41例均取其癌旁正常大肠组织(距癌灶边缘为5 cm左右)为对照，肿瘤组织和邻近正常组织均于术中快速切取，所有标本立即剔除血块及脂肪组织，置-20℃冰箱中冷冻保存。病理学分型：管状腺癌34例，粘液腺癌7例。
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V,~ I8_$xy3Q A0 1.1.2 试剂与仪器 PCR扩增反应体系试剂购自大连宝生物工程有限公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司，引物合成由大连宝生物工程有限公司完成，提取DNA的试剂盒为上海生工生物工程公司产品。主要仪器：基因扩增仪(TC-96/T/H，杭州博日科技有限公司)，紫外透射反射分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)，DYCZ-24D型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，TS-1脱色摇床(金坛市华峰仪器有限公司)。
中国论文网bk c.V8\h;a Vw*{r中国论文网b DA{1v5fe%h 1.2 方法
_~r7i%\0t|-h4G l V A&p d1q0 1.2.1 DNA提取 采用上海生工公司生产的SK1342临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒提取组织中DNA,作为PCR反应的模板。具体步骤如下：(1)样品准备：称取25～30 mg组织样品，用手术刀切成碎末，并收集到1.5 mL离心管中，用200 μL TE悬浮;(2)加入400 μL Digestion Buffer混匀;(3)加入3 μL Proteinase K,混匀，55℃保温3 h，直至组织完全降解，即完全透明，不粘稠。(4)加入260 μL无水乙醇，混匀，然后将样品全部转移到套放于2 mL收集管内的UNIQ-10柱中;(5)室温离心10 000 rpm 1 min;(6)取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入500 μL Wash solution,室温离心10 000 rpm 1 min;(7)重复步骤(6)1次;(8)取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10 000 rpm,室温离心30 s，以彻底除去残留的Wash Solution;(9)将柱放入新的洁净的1.5 mL离心管中，在柱中央加入50 μL Elution Buffer,室温放置2 min;(10)10 000 rpm,室温离心1 min，离心管中的液体即为基因组DNA。样品置于-20 ℃保存。
快速发表论文 中国论文网8Ob I {Y%f~4gT3@4_M
c v0 1.2.2 引物序列 根据文献报道[4],选择该基因 D17S579位点合成一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。D17S579引物序列为：上游引物：5′-AGT CCT GTA GAC AAA ACC TG-3′，下游引物：5′-CAG TTT CAT ACC AAG TTC CT-3′，扩增产物为111个碱基。
rV'h&P8bI p n0&m%J S t$M0 1.2.3 D17S579位点的PCR扩增 总反应体系25 μL，内含DNA样品0.1 μg，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 μL，Taq DNA聚合酶2 U，加入D17S579位点的上、下游引物终浓度为0.33 μM，双蒸水补足反应体积至25 μL。再加入无菌液体石蜡1滴。PCR循环参数：D17S579预变性95 ℃，5 min;变性94 ℃，40 s;退火62 ℃，50 s;延伸72 ℃，1 min，共35个循环。末轮循环72 ℃延伸10 min。PCR产物鉴定：取6 μL PCR扩增产物并加入1 μL溴酚蓝载样液，经2.0 %含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定，经紫外灯下观察，证实PCR扩增成功，其余的置于-20 ℃保存备用。
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Z-w*]3\3{中国论文网*T-TV xW/~ f:l6s { K 1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 取D17S579的PCR扩增产物3 μL,加3 μL上样液(95 %去离子酰胺，4.9 % EDTA,0.05 %二甲苯氰，0.05 %溴酚蓝)混匀后，沸水中变性10 min，冰上骤冷5 min，然后上样于8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(acrylamide∶bis=29∶1)，在1×TBE缓冲体系中连续电泳，电压75～80 V，电泳1～1.5 h，电泳至二甲苯氰适当位置，停止电泳，取出凝胶进行银染。
p {K"b l&T#}N0中国论文网*t P_khz 1.2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染观察 凝胶用硝酸银[5]染色，并加以改进，主要步骤如下：用双蒸水漂洗1 min，在摇床上于0.2 % AgNO3染色液中轻摇8 min，再用双蒸水漂洗1 min，加少量预冷的显影液，轻摇10 s，弃去反应液，加入200 mL显影液(2 % NaOH,0.04 % NaCO3，0.4 % 甲醛)轻摇，直至背景呈淡黄色，用双蒸水漂洗至条带清晰。
中国论文网 J u'o:T0_3p.c+~`0wu中国论文网/~ N`%MwJM/V.f 1.2.6 判断标准 正常大肠组织基因组DNA：D17S579位点PCR-SSCP电泳凝胶图中，只出现一条主带代表一个等位基因片段，为纯合子，如出现两条主带则为杂合子，后者用于LOH分析。肿瘤组织条带较正常组织相应等位基因条带减少，为LOH。肿瘤组织较正常组织等位基因条带增多或移位，为MSI。
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K0-|;Q0folp t0 1.2.7 统计学分析 数据用SPSS15.0进行统计学处理,MSI、LOH与临床病理因素的关系采用卡方检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
中国论文网#@q)@g0f W:] t{]快速发表论文 ,@PS `g om8b0 2 结果
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F0 2.1 大肠癌临床病理特性与MSI、LOH的关系 实验组和对照组D17S579位点微卫星片段均扩增成功，见图1。与正常组织比较，MSI表现为肿瘤组织等位基因条带增加或移位，LOH则出现肿瘤组织等位基因条带减少，见图2。
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XS中国论文网bcB!BHcp,q 正常组织(N1)和肿瘤组织(C1)条带无明显异常，肿瘤组织(C2)比正常组织(N2)少一条等位基因条带，为LOH阳性;肿瘤组织(C3)比正常组织(N3)多一条等位基因条带，为MSI阳性
/N7h(us!W!~\.Y9l|00d(c{(@g
h~ b7M0 在本实验中，D17S579位点MSI检出率为21.95 %(9/41)，在肿瘤TNM分期中，D17S579位点MSI检出率在Ⅰ+Ⅱ期(36.36 %)高于Ⅲ+Ⅳ期(5.26 %)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05);在肿瘤TNM分期中，D17S579位点LOH检出率在Ⅰ+Ⅱ期(0.00 %)低于Ⅲ+Ⅳ期(36.84 %)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 大肠癌D17S579位点遗传不稳定性与临床病理参数之间的关系
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y 3 讨论
中国论文网 `6e#`8m6gh-qC5V中国论文网\c#f(p/H*E6d 微卫星DNA指广泛存在于真核细胞基因组中的一类短的、简单的、串联的重复序列，又称为短小串联重复序列。微卫星DNA是在研究DNA多态性标记过程中发现的，1981年Miesfeldd等首次发现微卫星DNA，其重复单位长度一般为2～6个核苷酸，常见的有2、3、4核苷酸重复序列，尤以二核苷酸的重复序列(CA/GT)最为常见。每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中心的核心区和外围的侧翼区。核心区含有一个以上称为“重复”的短序列，一般该重复单位的碱基对数目不变，而串连在一起的重复单位数目是随机改变的[6]。
*ll(B#b5gJ:uVP0中国论文网$f'I4X:C y!qfH 微卫星不稳定性是指在一些恶性肿瘤中，微卫星的串联序列的重复数目常与正常微卫星DNA不同，这一现象称为微卫星不稳定性。MSI的发生系由于错配修复基因突变引起基因组DNA复制精确度降低所致。MSI是由于复制差错引起的重复序列缺失、扩增或插入改变使细胞不能正常地发挥调控作用，使细胞的增殖及分化发生异常，由此导致了肿瘤的发生[6]。Jackson等[7]研究认为,微卫星序列长度的改变是与复制过程中“滑链(miss- chain)”有关。在酵母等非肿瘤细胞中，这种“滑链(miss-chain)”由错配修复系统修复，而在肿瘤细胞中，这种修复不能进行，所以他们强调，错配修复系统异常是导致MSI产生的原因。错配修复基因缺陷是肿瘤发生的早期事件，本身并不引起肿瘤，但它使DNA复制的忠实性降低，抑癌基因或原癌基因的突变增多，最终导致肿瘤的发生。
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x7zN@~f&h-L:C02B-Y2|%a `0 LOH是由于杂合性位点的等位基因丢失所致，肿瘤抑制基因的失活是结直肠癌进展的遗传机制之一。根据Knudson[4]的抑癌基因 (tumor suppressor gene,TSG)失活的“二次打击”学说,发生LOH的染色体区域存在TSG，因此，LOH是发现抑癌基因有效的分子遗传标志。
Q+irSp#LT/b0快速发表论文 中国论文网GT9D[ AJ 1990年，Hall等[8]首次利用PCMM86探针，通过基因连锁分析发现了早发家族性乳腺癌与第17号染色体长臂(17qD17S74位点)的连锁;1994年由美国科学家Miki Y等组成的Skolnick研究小组成功地完成了BRCA1克隆，BRCA1基因位于17号染色体长臂(17q21D17S1321- D17S1325)，是世界上第一个被发现的家族性乳腺癌抑癌基因。目前，BRCA1基因与卵巢癌、乳腺癌的关系已得到证实，而且Elena等认为 BRCA1基因也可能与结肠癌的发生、发展相关，并发现在 BRCA1基因各位点中，D17S579位点是检测抑癌基因的很好候选位点[9]。国内的研究，徐宁等对遗传性非息肉病性结直肠癌与微卫星不稳定性关系的研究，结论是微卫星不稳定是遗传性非息肉病性结直肠癌常见的分子学事件，遗传性非息肉病性结直肠癌有其特有的生物学特性。而对散发性结直肠癌研究的较少，因此，本实验选择D17S579位点的MSI与LOH来检测在散发性大肠癌中是否也存在相关性。
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C-[/R中国论文网 i'L.\#G? U lw 本实验中，在大肠癌TNMⅠ+Ⅱ期，D17S579位点的MSI检出率高于TNMⅢ+Ⅳ期，差异有统计学意义，提示MSI与判断肿瘤进展的 TNM临床分期有关，并发现随着大肠癌进展，MSI发生趋于减少，即散发性大肠癌早期MSI检出率较高。所以,我们认为MSI可作为散发性大肠癌的早期分子学诊断指标。Berney等[4]研究认为MSI可以作为结直肠癌良好预后的一个标志，我们的实验结果也支持这一观点。Candusso等[10]的研究发现LOH多发生在肿瘤的晚期，与本实验结果相符，在TNMⅠ+Ⅱ期，D17S579位点LOH检出率明显低于TNMⅢ+Ⅳ期。结果表明，LOH多发生于大肠癌晚期，可作为大肠癌恶性程度、预后转归的判断指标。
中国论文网n q\ h_ dd.tk { w0 目前，微卫星DNA不稳定性作为肿瘤细胞的基因标志物，在肿瘤研究中愈来愈被人们重视。由于微卫星重复单位较小，检测困难，因此限制了其多态性的应用。由于PCR-SSCP技术的建立和应用，使微卫星标记在遗传病连锁分析、肿瘤等领域的应用成为可能。随着分子生物学技术的飞速发展，已认识到癌基因及癌抑制基因的异常改变在人类恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用，尤其是癌抑制基因的功能丧失越来越受到人们的重视。利用微卫星标记位点进行LOH分析技术，已成为癌抑制基因重要的筛选手段之一，加上PCR银染法灵敏度高、安全、经济，大肠癌早期即可出现遗传学方面的改变，以微卫星不稳定性及杂合性缺失为指标，可指导进一步进行这些位点附近的高密度图谱分析，寻找此位点附近的最小缺失片段，为寻找新的抑癌基因奠定了基础。这种检测将有可能作为一种具有早期诊断的筛选检测方法以及预后判断的无创伤性检测技术而广泛应用于临床。
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