【摘要】 目的：检测乳腺癌及癌旁组织中PTEN 基因5’端CpG岛启动子区域的甲基化状况。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)方法对乳腺癌及癌旁组织中PTEN基因5’端CpG岛启动子区域甲基化状况进行研究。结果：乳腺肿瘤组织中PTEN基因甲基化率为 31.5 %(29/92)，显著高于癌旁组织和正常组织(P<0.05)，而癌旁组织和正常乳腺组织中甲基化率均比较低，分别为8.3 %(2/24)、6.2 %(1/16)，两者差异无统计学意义(P>0.05);PTEN基因甲基化与肿瘤组织学类型、年龄及肿瘤大小均无相关性，但与淋巴结转移相关 (P<0.05)，淋巴结转移组PTEN基因甲基化率显著高于无淋巴结转移组。结论：PTEN基因5’端CpG岛启动子区域甲基化可能是散发性乳腺癌PTEN基因失活的主要机制，参与了乳腺癌的发生发展过程;PTEN基因甲基化可能是乳腺癌发生发展过程中的晚期事件，提示可以考虑将PTEN基因甲基化作为评价乳腺癌肿瘤细胞转移潜能的分子标记。
#l$u2ZfE0如何发表论文 $]0`"X2z6U%I0【关键词】 乳腺癌/病理学;PTEN 基因;甲基化
G r]FYB E O.O/Z0中国论文网H.f8xV"E6B Abstract Objective: To investigate the promoter methylation of gene PTEN5' in breast carcinomas and in tissues adjacent to breast cancer. Methods: 92 specimens of breast carcinomas, 24 specimens of tissues adjacent to breast cancer and 16 normal specimens of breast tissues were examined for promoter methylation of PTEN5' with methylation-specific PCR method. Results: Methylation of PTEN was found in 31.5 % (29/92) of the total breast carcinoma specimens, while in 8.3 %(2/24)of total specimens of tissues adjacent to breast cancer and in 6.2 %(1/16) of normal specimens of breast tissues respectively. In addition, promoter methylation of PTEN5' was significantly associated with lymph node metastasis (P<0.05), but was not associated with differentiation status, tumor size and age. Conclusion: Promoter methylation of PTEN5' is an important mechanism for its inactivation. Methylation of PTEN is a common event in breast carcinomas and may play an important role in the carcinogenesis and progression of breast carcinomas.
中国论文网I&vX(Z!g如何发表论文 q ?"n]%I5j)G0 Key words Breast cancer/pathol; Genes PTEN; DNA Methylation
i;E2j:@ ^0!n9b:F*`jy0 PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)基因位于人染色体10q23.3[1]，是第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因[2]，其主要功能包括参与胚胎的正常发育[3]、通过 G1期阻滞或诱导细胞凋亡而抑制细胞生长[4]、抑制端粒酶活性[5]以及抑制细胞迁移、铺展和局部粘附[6]。人类多种恶性肿瘤的发生、发展与该基因的突变失活密切相关。PTEN基因的突变包括胚系突变和体细胞突变。胚系PTEN基因的突变可以引发3种罕见的常染色体显性遗传肿瘤综合征：Cowden 病、Lhermitte-Duclos病和Bannayan-Zonana综合征。这些综合征在临床上主要表现为形成多发性错构瘤，且易伴发恶性肿瘤，女性病人则有30 %～50 %发生乳腺癌。体细胞突变见于约40 %的胶质母细胞瘤及30 %的前列腺癌，而只有在极少数原发散发性乳腺癌中可检测到PTEN 基因突变或(和)染色体缺失。基因失活除了突变和缺失外，5’端CpG岛甲基化也是一个非常重要的途径[7-9]。目前关于PTEN基因甲基化与乳腺癌关系的研究在国外已有报道[10]，国内还未见报道。本研究检测了原发散发性乳腺癌及其癌旁组织中PTEN基因甲基化状态，分析PTEN 基因甲基化在癌组织与癌旁组织中的差异以及与临床病理指标之间的关系，旨在探讨PTEN基因甲基化在乳腺癌发生发展过程中所起的作用，希望能为乳腺癌的临床治疗和跟踪肿瘤预后方面提供一些参考。
中国论文网!Z_7x"D+S(t&QO$dt%~(c如何发表论文 AN$dg5{!b:k)M0 1 材料与方法
中国论文网wS9R+T Aee`中国论文网ln4G)yd"A:h!M 1.1 材料 乳腺癌、癌旁组织标本来自包头医学院病理学教研室在2003-2007年间乳腺癌根治术或乳腺癌改良根治术标本，共92例，年龄 33～74岁，平均为48.6岁;乳腺癌组织学分型：导管内癌4例;导管浸润癌88例。24例癌旁组织选择远离癌组织的乳腺组织，镜下无肿瘤组织，但可见导管上皮单纯增生或不典型增生，部分病例可见大汗腺样化生，年龄范围在38～71岁，平均为50.9岁。16例正常乳腺组织(对照)无大汗腺样化生、异型增生等病变，年龄范围在38～67岁，平均年龄为50.1岁。
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H YY@%a+B0 1.2 甲基化特异性PCR方法 (1)DNA提取方法：每个蜡块切4 μm厚蜡片30张，按常规蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取癌组织、癌旁组织和正常组织基因组DNA，三蒸水溶解后，用紫外分光光度仪测量DNA浓度。 DNA于-20 ℃保存。所用蛋白酶K为美国Sigma公司产品。酚/氯仿/异戊醇试剂(体积比为25∶24∶1)为Invitrogen公司产品。(2)甲基化特异性 PCR(MSP)方法：每个样本取5 μg DNA用0.2 M NaOH变性处理，于10 mM氢醌(Sigma公司)和3 M亚硫酸氢钠(Sigma公司)中50 ℃反应24 h,然后，用Wizard DNA纯化试剂盒(promega公司)纯化经亚硫酸氢钠处理的DNA。DNA经亚硫酸氢盐处理后，DNA中的C转变为U，而如果被检测基因已经发生 CpG岛甲基化，则不能发生这种改变，设计甲基化特异性PCR引物和非甲基化特异性PCR引物，就可检测出该基因是否发生甲基化。我们根据文献报道[10]，选择PTEN基因启动子区域甲基化热点合成两对引物，一对为检测甲基化PTEN基因特异性PCR引物，另一对为检测非甲基化PTEN基因特异性PCR引物。引物序列见表1。PCR扩增体系为12.5 μL，包括1×PCR反应缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L上下游引物，2.5 mmol/L MgCl2,0.05 U HotStar Taq酶，100～250 ng经亚硫酸盐处理的DNA模板。PCR扩增试剂均为Qiagen公司产品。PCR的阴性对照用三蒸水取代DNA模板进行PCR。
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Gz0如何发表论文 9q fk;z$jd+|X p0 表1 甲基化特异性PCR(MSP)引物
中国论文网"n @O8B k@sH中国论文网 \ X*?/\n;p4j 引物*正义序列( 5'-3')反义序列( 5'-3')参考文献PTEN-UTTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGTACACAATCACATCCCAACACCAKhan et alPTEN -MTTTTTTTTCGGTTTTTCGAGGCCAATCGCGTCCCAACGCCGKhan et al *注：U为未甲基化特定引物;M为甲基化特定引物
中国论文网S gR"K SS q-P中国论文网 A } H+gL dO 1.3 统计分析方法 应用SPSS 13.0软件行χ2检验、Fisher确切概率法。
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q*l0C 2 结果
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k0 2.1 乳腺癌及癌旁组织中PTEN基因甲基化状况 92例乳腺癌组织中，29例肿瘤检测到PTEN基因甲基化，甲基化率为31.5 %(29/92)，癌组织PTEN甲基化率显著高于癌旁组织和正常组织(为排除样本量差异带来的误差，采取先加权，后检验。Fisher确切概率法 P=0.021、P=0.038)。而24例癌旁组织只有2例(2/24)、16例正常乳腺组织只有1例检测到PTEN 基因甲基化，且两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。图1显示检测正常组织、癌旁组织和肿瘤组织PTEN 基因甲基化的结果。
中国论文网4p6e}9q#M(X*d中国论文网4SP;\Hn6SZ A *为100 bp DNA分子量标记物，TABC▲为癌旁组织，U表示用非甲基化特异引物进行PCR，M表示用甲基化特异引物进行PCR。A为用PTEN-U和PTEN-M PCR引物分别检测正常组织、癌旁组织和肿瘤组织中PTEN非甲基化的基因拷贝与甲基化的基因拷贝
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O0m)q y'ick:V2.2 PTEN基因甲基化和临床病理指标的相关性 PTEN基因甲基化率显著高于癌旁组织，且与淋巴结转移相关(P<0.01)，淋巴结转移组PTEN基因甲基化率显著高于无淋巴结转移组,但PTEN基因甲基化与肿瘤组织学分型、年龄、肿瘤大小均不相关。见表2。表2 PTEN基因甲基化状态与患者临床病理参数间的关系
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h:L9@*W5]cber 3 讨论
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T3R2aU2I0tE$K0 PTEN基因是第一个具有磷酸酶功能的肿瘤抑制基因，其在肿瘤中的突变频率与著名的p53基因相当[11]，但国外研究发现散发性乳腺癌中 PTEN基因点突变仅为5%左右[12]，且主要发生在晚期和转移癌中。此外，研究还发现乳腺特异性PTEN缺失会导致乳腺上皮细胞增生、分化，乳腺小叶腺泡早熟，导管上皮细胞局灶性增生、发育不良，这种组织学改变有如Cowden Disease的乳腺表型[13]。而Rose等[14]人研究表明散发性乳腺癌中PTEN基因突变或(和)缺失所占的比例不大(6 %)。基因失活除了突变、缺失的原因外，异常甲基化是其又一重要机制。我们检测了92例乳腺癌组织中的PTEN甲基化状况，发现29例发生甲基化，甲基化率为31.5 %(29/92)，显著高于正常组织，提示PTEN基因5’CpG岛甲基化是乳腺癌患者常见的分子事件，可能是散发性乳腺癌PTEN基因失活的主要机制，参与了乳腺癌的发生发展过程。国外研究报道散发性乳腺癌中 PTEN基因甲基化率为30 %～48 %，显著高于正常组织[10,15]，与我们的结论一致。而24例癌旁组织只有2例(2/24)检测到PTEN 基因甲基化，显著低于癌组织PTEN基因甲基化率，国内外尚未见有类似报道。研究结果表明PTEN基因甲基化是乳腺癌发生发展的一种信号，但却是晚期事件，提示PTEN基因甲基化可能不能够作为早期预测乳腺癌发生风险的分子标记。
}2n)A[$@#u J2G2e0B0 W Ny8a ^:p]0 我们进一步分析发现，PTEN基因甲基化与患者年龄、肿瘤大小以及组织学类型无相关性，而与淋巴结转移相关，发生转移的病例大多是PTEN基因发生甲基化的病例，进一步证实了PTEN基因甲基化和肿瘤的进展相关，提示可以考虑将PTEN基因5’CpG岛甲基化作为评价肿瘤细胞转移潜能的分子标记，也可以为肿瘤预后提供参考。
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W%YQ0如何发表论文 7Tf'm6}6B*Ou0 有趣的是，正如我们所预期的，在能检测到PTEN基因甲基化的部分肿瘤组织中也能检测到PTEN基因的未甲基化，可能是由于肿瘤组织中混有癌旁组织、或基因发生不完全甲基化所致。以前我们曾在胃癌组织基因甲基化研究中也发现类似的结果[16]。值得注意的是，从理论上讲正常组织中不应该检测到 PTEN基因甲基化，但我们在极少数癌旁组织和正常乳腺组织也检测到了PTEN基因甲基化，可能是因为PTEN基因发生了部分甲基化，但还不足以引起基因失活和肿瘤发生。Khan等[10]也认为基因5’CpG岛甲基化密度逐渐增加是一个动态过程，当其增加到一定程度就会导致基因失活，而对于抑癌基因来讲，可能发生肿瘤。由于PTEN是近十几年新发现的抑癌基因，又具有磷酸酶功能，是否与其它抑癌基因能够相互作用，或者是否在肿瘤发生发展的不同时段分别起不同的作用，还有待于进一步研究探讨。
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