MDA?7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

4o?~t}t7j0【摘要】  构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA?7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒，并初步探索其抗肿瘤活性。方法： 通过基因操作技术将启动子（hTERTp）+目的基因(MDA?7)插入到5型腺病毒E1A区域，构建复制缺陷型腺病毒AdTP?mda7；同时构建对照病毒AdTP?EGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA?7在肿瘤细胞株中的表达状态；通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果： 成功构建携带目的基因的腺病毒载体，PCR鉴定正确；蛋白质印迹结果表明MDA?7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡，如A549，SGC?7901等，在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时，原代细胞中没有检测到MDA?7表达；结晶紫染色试验结果表明AdTP?mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP?EGFP。结论： 成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP?mda7，并证实MDA?7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。 中国论文发表

.AUlN$k `0A!Lc-M0【关键词】  复制缺陷型腺病毒 端粒酶启动子 肿瘤基因治疗

    ［Abstract］  Objective: To develop a proliferation?deficient adenovirus for gene therapy in which the hTERT promoter was introduced to regulate the expression of the target gene in tumor cells.Methods： A tumor?specific proliferation?difficient adenovirus vector was constructed by employing  the human telomerase reverse transcriptase (hTERT)promoter to drive the expression of adenovirus?mediated target gene; at the same time AdSuTP?EGFP was constructed as control.Titer was  obtained by TCID50 method.The expression of MDA?7 was detected by western blot and the appearance of senescence was assessed by violet staining.Cells were photographed 2h after staining. Results： Two adenovirus vectors including target gene were successfully constructed and identified by PCR technology.Western blot analysed that MDA?7 selectively expressed in tumor cell lines MHCC, SGC7901,  A549, and so on, and induced apoptosis，while primary lung fibroblast was transduced at equal MOI level and did not express detectable levels of MDA?7; violet staining test verified directly that killing effect of AdTP?mda7 was great stronger than AdTP?EGFP，supporting that one of the functions of MDA?7 was apoptosis induction. Conclusion： proliferation?deficient adenovirus, AdTP?mda7, was successfully constructed, simultaneously verified that the overexpression of  MDA?7 in tumor cells induced tumor cell apoptosis, which was a novel gene?virus therapeutic system and significant for targeted tumor gene therapy.中国论文发表中国论文网/B[+c2A,Y,J&kv-I

D"XL(_P%uQ0    ［Key words］  replication?deficient adenovirus； telomerase reverse transcriptase（hTERT）promoter； tumor?targeted gene therapy中国论文网H Mb(eAmy

    黑色素瘤分化相关基因?7（MDA?7），是1995年由哥伦比亚大学Jiang等［1］通过差减杂交方法从干扰素和瑞香素诱导的终末分化的人黑色素瘤细胞HO?1中分离获得的一种新基因，具有肿瘤抑制因子和细胞因子活性。2001年根据其基因定位和分子结构将其归为IL?10家族，重命名为IL?24［2］。研究发现MDA?7蛋白对多种人肿瘤细胞（包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤、肠癌和神经胶质瘤等）的生长均有抑制作用，并可抑制血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞没有影响［3］。

v*R&AsQ9E!X0    增殖性腺病毒在肿瘤研究方面具有很好的理论优势，但是人体内环境是一个极其复杂神秘的整体，考虑到安全性，我们选择构建复制缺陷型腺病毒。端粒酶阳性表达是人类实体瘤的重要特性，在85％以上的肿瘤细胞中端粒酶表达阳性，而在绝大多数正常体细胞中为阴性［3］。利用这一特性，我们设计构建一种复制缺陷型腺病毒AdTP?mda7，用人端粒酶反转录酶启动子（hTERTp）调控MDA?7蛋白表达，更好地实现MDA?7对肿瘤细胞的杀伤效应，为肿瘤的基因治疗和临床研究提供依据。中国论文发表

    1  材料和方法

#TU NRvT.qKG-}0    1.1  实验材料

k)x-M)@ m\9t5N4b|_0    人肺腺癌细胞株（A549）、人胃癌细胞株（SGC?7901）购于中国科学院上海细胞研究所。人原代肺成纤维细胞由本室培养保存。胎牛血清、DMEM、RPMI1640购自美国Gibco BRL公司。pUC19,pDC312,DH5α、携带EGFP报告基因的腺病毒载体质粒pAdTP?EGFP、含有5型腺病毒右臂基因组且E1/E3区缺失的腺病毒骨架质粒pBHGE3由本实验室保存。转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。限制性内切酶、T4连接酶系TaKaRa大连生物技术有限公司产品。抗MDA?7抗体购自美国R&D公司。  中国论文网uJ2B
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X6N0    目的基因（MDA?7）引物（P1：3′?CGGCTAGCACCATGAATTTTCAACAGA?5′,P2：5′?GCGTCGACT TATCAGAGCTTGTAGAAT?3′）,EGFP基因引物(P3：3′?GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC?5′, P4：5′?CGGGATCCGTCGACTTATTACCTAGATCCGGTGG?3′),E1A基因引物（ P5：3′?GCTCT AGAACCATGAGACATATTATC?5′, P６：5′?GCGTCGACTTATGGCCTGGGGCG?3′）由上海生工生物工程有限公司合成。中国论文网4aU Sid

4\'Gv2w%Z/qq;yj0    1.2  腺病毒载体构建中国论文网0O,bf2uL/AN!D}8Ie

    全基因合成258 bp hTERT启动子（hTERTp），克隆到腺病毒穿梭质粒中构成pSuTP，将MDA?7的Nhe I+Sal I双酶切片段插入质粒pSuTP 的hTERTp启动子下游相应位点，得到重组载体pSuTP?mda7即pAdTP?mda7，经双酶切鉴定，释放相应条带符合预期大小，证明是所需阳性重组体。中国论文网-J9i*s(|6`,S(f
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    1.3  腺病毒的包装、鉴定及滴度测定

    将腺病毒穿梭质粒pAdTP?mda7,pAdTP?EGFP分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3（包含除了5型腺病毒左端188～1 339 bp以外的整个5型腺病毒基因组）经脂质体Lipofectamine 2000共转染至HEK293细胞，进行细胞内同源重组获得重组病毒。采用PCR进行鉴定，正确后命名为AdTP?mda7和AdTP?EGFP。病毒在HEK293细胞中反复扩增到需要量，通过氯化铯梯度离心纯化病毒。采用TCID50法测定病毒滴度。中国论文网+w~K&rc$F

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|;U{c0    1.4  蛋白质印迹分析中国论文网s-qG3i0Z~$}B

    由于各种细胞株对病毒感染和病毒产物的敏感度不同，所以我们选用了两个肿瘤细胞株，一种正常原代细胞用作对照。将肿瘤细胞和正常细胞接种于6孔板，2×105细胞/孔，24 h后感染病毒，以MOI=10加入AdTP?mda7，37℃ 5％CO2培养箱中继续培养，48，72 h后裂解细胞，蛋白质印迹检测肿瘤细胞中MDA?7的表达。

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w4}"x0    1.5  结晶紫染色实验中国论文网aF+P5UO1JW(fm

p:bL6w`w0|0    将肿瘤细胞和正常细胞分别接种于24孔板，分别以不同MOI值感染AdTP?mda7，AdTP?EGFP，72 h后取出24孔板，预冷PBS洗3遍，4%甲醛固定30 min，结晶紫染色1 min，自来水冲洗，拍干。观察目的蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的效果。中国论文发表

(g3jC+v+y0    2  结  果中国论文网'yC:c"WT
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    2.1  重组腺病毒的包装、鉴定和扩增

    穿梭质粒和骨架质粒共转染至铺有HEK293细胞的6孔板约9天出现肉眼可见第一代腺病毒噬斑，吸取单个噬斑至24孔板中，一孔一斑，小量扩增后将细胞和培养液一同收起， 37℃/－80℃反复冻融3次后，12 000 r/min离心15 min，弃去细胞碎片，取上清液汇总混匀后分装,用于重组腺病毒的鉴定及大量扩增。取10 μl病毒悬液加等量蛋白酶K（20 mg/ml），55℃处理1 h，100℃灭活5 min。取2 μl作为模板进行PCR鉴定。用引物P1/P2鉴定MDA?7，用引物P3/P4鉴定EGFP。鉴定正确后，分装到1.5 ml dorf管中备用。鉴定结果表明，两种病毒均为高纯度复制缺陷性重组腺病毒。用HEK293细胞进行重组腺病毒大量扩增,氯化铯梯度离心法纯化病毒。TCID50法测得病毒滴度AdTP?mda7为2.69×109 pfu/ml、对照病毒AdTP?EGFP滴度为1.8×108pfu/ml。两种病毒大量扩增，反复冻融，混匀，按上述条件处理后鉴定有无交叉污染，另外用引物P5/P6鉴定病毒有无E1A基因片段。

6rsAaDby#}$Vj0    2.2  蛋白质印迹分析结果

    以MOI=0，20，50分别感染接种于6孔板的胃癌细胞株SGC?7901、人肺腺癌细胞株A549；以MOI=0，50分别感染正常原代肺成纤维细胞，72 h后收取细胞裂解液做蛋白质印迹分析。实验结果显示感染病毒的肿瘤细胞株中有MDA?7蛋白表达条带，呈剂量依赖性，正常细胞相同处理后收取的裂解液中没有可检测水平的MDA?7蛋白表达条带（图1）。中国论文网XSG.Yt@7fr0mw

"?5k%u1Kn7Y0m0    2.3  结晶紫染色结果

%lUkEx#q_:UQ'e&b[0    将胃癌细胞株SGC?7901、肺腺癌细胞株A549各接种于一块24孔板，分为3组，每组4个复孔接种相同的细胞数1×105/孔。24 h后感染病毒，每组每孔加入1 ml无血清培养基后，以MOI=10，100，1 000，10 000梯度分组感染AdTP?mda7或AdTP?EGFP，PBS作为阴性对照。72 h后结晶紫染色。吸干培养基，用预冷PBS轻轻洗涤两遍，吸干，甲醛常温固定30 min，结晶紫染色，1 min后流水冲洗，拍干，观察颜色差异。颜色浅代表细胞损伤严重。结果显示两种肿瘤细胞中感染AdTP?mda7的一组细胞大量死亡的MOI值为10，感染对照病毒的肿瘤细胞在MOI为10 000时才出现明显的死亡。说明AdTP?mda7的肿瘤细胞杀伤效应远远大于对照病毒AdTP?EGFP（图2）。中国论文发表中国论文网 V%t/T0~tG E

    3  讨  论

    黑色素瘤分化相关基因?7(MDA?7)是近年来发现的一种新型肿瘤抑制基因，同时具有细胞因子活性，在肿瘤形成过程中其MDA?7蛋白的表达降低，在恶性程度高的肿瘤中则检测不到其表达［1］。MDA?7的表达与肿瘤恶性化程度成高度负相关。在大多数肿瘤细胞株中，MDA?7的抗瘤抑瘤活性主要表现为：① MDA?7的过表达能够抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡；②细胞周期被阻滞在G2/M期［4］，肿瘤细胞分裂增殖受抑制；③ MDA?7具有细胞因子活性，可以激发免疫反应，刺激机体进一步抵抗肿瘤的攻击；④分泌到细胞外被糖基化修饰的MDA?7蛋白具有抗新生血管生成作用［5］，具有抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡活性的是分布于细胞内质网的MDA?7蛋白［6］；⑤ MDA?7蛋白与IL?20R结合后可以大大增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，从而起到杀伤肿瘤细胞的效果。

3x6dte(I#r4Ja;X:vh0    目前有许多研究者选择肿瘤特异性启动子来调控腺病毒靶向性。研究表明，在85％以上的人肿瘤细胞中hTERT活性很高［3］，而在除造血细胞和胚胎干细胞以外的正常细胞中却没有活性，提示hTERT启动子可以作为广泛性的肿瘤特异性启动子来调控携带目的基因的表达［7］，使腺病毒特异性作用于端粒酶阳性的肿瘤细胞，产生凋亡和杀伤效应。利用5型腺病毒对造血细胞和胚胎干细胞感染能力差的特点，可以避免病毒对端粒酶弱阳性的造血细胞和胚胎干细胞的影响。中国论文网,wu/x'p+zS'r@

    本研究旨在通过构建的腺病毒载体将目的基因MDA?7运送到肿瘤细胞中，使相应蛋白MDA?7在不同种肿瘤细胞中表达，并检测MDA?7蛋白抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的活性。本实验构建的腺病毒载体，成功地将MDA?7置于hTERT启动子的控制之下，同时缺失腺病毒E1A和E1B55K基因，使病毒失去复制能力，构建成一种复制缺陷型基因治疗腺病毒载体AdTP?mda7。实验结果显示，我们所构建的AdTP?mda7感染肿瘤细胞后能有效表达MDA?7蛋白；而以相同浓度感染正常原代成纤维细胞则检测不到MDA?7蛋白条带，证明该病毒载体具有良好的肿瘤靶向性。两种肿瘤细胞结晶紫染色结果大致相同：MOI值为10时感染AdTP?mda7的一组细胞即出现大量死亡，感染对照病毒的肿瘤细胞在MOI为10 000时才出现明显的死亡。说明AdTP?mda7对肿瘤细胞的杀伤效应远远大于对照病毒AdTP?EGFP。由于两种腺病毒在组成结构上除了目的基因与对照基因不同，其余结构完全一样，实验中各种操作完全相同，因此，可以认为两种病毒的感染效率大致相同。由此得出结论，腺病毒AdTP?mda7对肿瘤细胞的强杀伤效应是MDA?7带来的，也就是说，体外实验中，MDA?7能够诱导肿瘤细胞凋亡，为进一步的体内实验和临床肿瘤的基因治疗提供了可靠的载体和新的策略。中国论文发表

 中国论文网1ltJ+Iwgh @q(KZ

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