【摘要】 目的 测定西安地区肠杆菌科细菌中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBL)的基因型。方法 在西安市的5所医院中随机选取产ESBL的肠杆菌科细菌25株(共125株)，采用PCR方法特异性扩增TEM、SHV和CTX-M型酶的基因片段。结果 在125株产ESBL菌中，有33株扩增出TEM型酶基因片段；有27株扩增出特异性SHV型酶基因片段；有49株扩增出特异性的CTX-M型酶基因片段；共有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。结论 在西安地区的ESBL肠杆菌科细菌中CTX-M型酶较为流行。
教育教学论文发表 z]O3I/A
J4eR0v0中国论文网-N l#\|&q)t'P【关键词】 肠杆菌科细菌；超广谱β-内酰胺酶；基因型
8t4@} ] OMK%q:y0中国论文网O(k*p VC:U1W ABSTRACT: Objective To study the genotypes of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Xi’an city. Methods Totally 125 ESBL-producing nterobacteriaceae strains were randomly selected from five hospitals of Xi’an City, and TEM-type, SHV-type and CTX-M-type ESBL genes were amplified by PCR. Results Among the 125 ESBL-producing Enterobacteriaceae strains, TEM-type ESBL genes were amplified from 33 strains, SHV-type ESBL genes were amplified from 26 strains, CTX-M-type ESBL genes were amplified from 49 strains, and two or more type ESBL genes were amplified from 22 strains. Conclusion CTX-M-type ESBL are prevalent in ESBL-producing Enterbacteriaceae in Xi’an City.
/a)_LE Wd0k:H1@%I0{2W*tx0 KEY WORDS: enterobacteriaceae; extended-spectrum β-lactamases; genotype
教育教学论文发表 :A&c7}u.n| Z0中国论文网;R.]c%a
?7|w-r0P^*jm 产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBL)是肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素耐药的最主要机制。肠杆菌科细菌特别是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是产生ESBL的最主要细菌［1］。为了解西安市产ESBL肠杆菌科细菌中ESBL基因型的流行情况，我们对2002年9月至2003年8月西安市5所三甲医院分离到的部分产ESBL肠杆菌科细菌进行了基因型的测定。
4Cg d.p7G0中国论文网pS@4N QYr wx,c6B 1 材料与方法
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B)_'xu_中国论文网u f,kbf 1.1 实验的菌株
中国论文网3}h#h Q.fx&E 中国论文网%H{P6}r.@ m]%y 2002年9月至2003年8月从西安交通大学医学院第二附属医院、第四军医大学唐都医院、陕西省人民医院、西安市中心医院、西安市儿童医院5所医院的细菌室分离出非重复肠杆菌科细菌1 518株，经表型筛选和确证试验，共检出产ESBL菌株283株［2］。对每所医院的产ESBL菌株按分离的先后顺序进行编号，以随机数字法在每所医院随机选择25株菌株进行研究。细菌的鉴定由各医院细菌室独立进行，使用全自动化微生物鉴定仪Vitek60或Vitek32完成。
教育教学论文发表 中国论文网 `O\`C4{5w}o"{;XJ中国论文网8X1?#Q0J qiB 1.2 模板的制备
H2F4P fX6z} DV0 %Y6x.|e4rC^'P0 取单个菌落接种于5 mL LB肉汤中，于37 ℃振荡培养20 h。取1.5 mL菌悬液在4 ℃ 13 000 r/min条件下离心5 min，弃上清。在室温下使细菌沉淀干燥5 min，加入500 μL的无菌去离子水，振荡混悬。在95 ℃水浴中加热10 min后，4 ℃ 13 000 r/min离心5 min除去细胞碎片，将上清移入另一离心管中，此上清即为制备的模板DNA。
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Y8~6x sl 1.3 引物的设计
@\P C.R4W0~ r9i$|cyDr0 在美国国家生物技术信息中心上查找各型ESBL的基因序列，使用引物设计软件Primer 3设计引物(表1)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。表1 PCR反应所用的引物（略）
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g5B'x0 1.4 PCR
7SC Cv%[:kp)o0$_)@:k"_jhp&H,e1S0 PCR在DNA热循环仪(DNA Thermal Cycler 480)上进行。三型酶的扩增条件相同。反应总体积为50 μL，其中10×Buffer为5 μL；dNTP混合物，各组分均为0.2 mmol/L；Taq酶2u；左右侧引物各0.5 μmol/L；氯化镁浓度为2.0 mol/L；模板2 μL。短暂离心混合物后，加入矿物油30 μL。PCR循环条件为93 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环。在首个循环前于93 ℃预变性5 min。循环结束后，于72 ℃再延伸10 min。整个反应结束后，将PCR仪置于4 ℃环境中。
教育教学论文发表 中国论文网7X7CA%@,k`中国论文网5?$M2Qji(xu` 1.5 琼脂糖电泳
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MU kSj F)b"Y q:la8g0 在含溴化乙锭(浓度为0.5 μmol/L)的琼脂糖凝胶中电泳分离PCR反应产物。电泳缓冲液为0.5×TBE Buffer，电泳后紫外灯下观察结果。
中国论文网 @;l2H `2gt1K H中国论文网,I*{.WT1d6?
d 1.6 质量控制
n'B6I3Q4@2\-c8l"m^^ G0 "[w[R1w I#H0 SHV型酶的基因测定选用肺炎克雷伯菌ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照，TEM型酶以及CTX-M型酶基因测定选用肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照。
&o%[ufz,qR0k&?3O(V oCv9U:G-i^0 2 结果
中国论文网-Tz~S2c t w ^ L+}m9xqo$Ls S,k0 2.1 细菌分布
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W-y0 在测定的125株细菌中大肠埃希菌52株，肺炎/产酸克雷伯菌47株，阴沟肠杆菌9株，产气肠杆菌7株，其他肠杆菌科细菌10株。
vP2o zw:e02.2 TEM型酶基因的扩增结果
Hh;ux[*w c8hk0+c%] j1Ve$}0 125株细菌中，有33株细菌扩增出特异性TEM型酶基因片段，其中有大肠埃希菌23株，肺炎克雷伯菌5株，产酸克雷伯菌1株，阴沟肠杆菌2株，产气肠杆菌2株。肺炎克雷伯菌ATCC700603中未扩增到特异的TEM酶基因片段(图1)。
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@8T'f)~g"m0#L0M v3[ o[0 2.3 SHV型酶基因的扩增结果
中国论文网-x/eyYK#tL I|G-tJ0 125株细菌中，有27株菌扩增出特异性SHV型酶基因片段，其中肺炎克雷伯菌13株，产酸克雷伯菌8株，大肠埃希菌5株，阴沟肠杆菌1株。肺炎克雷伯菌ATCC700603扩增出特异性SHV型酶基因片段，而大肠埃希菌ATCC25922未扩增出特异性基因片段(图2)。
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I-zok,l\7|0 2.4 CTX-M型酶基因的扩增结果
S!i9Hu m:[1Qe3@F[0 #i7f j'w'B#\ _5y y0 125株细菌中，有49株菌扩增出特异性CTX-M型酶基因片段，其中大肠埃希菌29株，肺炎克雷伯菌6株，产酸克雷伯菌5株，阴沟肠杆菌4株，产气肠杆菌2株，弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺菌和普通变形杆菌各1株。在肺炎克雷伯菌 ATCC700603中未扩增到特异的CTX-M型酶基因片段(图3)。
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G;M0 2.5 同时扩增出两种基因的细菌
's2b B i-f!@0i~n^!l\&Y,\j0 在125株细菌中，有1株大肠埃希菌同时扩增出TEM、SHV和CTX-M三型酶基因片段；同时扩增出TEM和SHV酶基因片段的细菌有5株，其中大肠埃希菌2株，肺炎克雷伯菌2株，阴沟肠杆菌1株；同时扩增出SHV和CTX-M酶基因片段的细菌有6株，其中大肠埃希菌2株，阴沟肠杆菌4株；同时扩增出TEM和CTX-M型酶基因片段的细菌共10株，其中大肠埃希菌8株，肺炎克雷伯菌1株，产气肠杆菌1株。
教育教学论文发表 {;EOCw?5d;Jae0中国论文网 M|_ Q$P/Q8t 3 讨 论
f,lIi,^V;s+`k)l0 dR%lU;Ni(Y"i C0 文献报道，ESBL是细菌产生的能水解大多数青霉素、头孢菌素和氨曲南等β-内酰胺类抗生素且活性能被酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦)抑制的一类β-内酰胺酶［3］。它是一种丝氨酸蛋白酶，属于分子分型的A型酶，功能分型的2be型酶。根据ESBL基因和蛋白质氨基酸序列的同源性将其分为四类：TEM型、 SHV型、CTX-M型、其他型。
中国论文网v!V#^xh5Q&Q"s %a!bac8n:Z0 在125株ESBL阳性菌株中，有33株扩增出特异性的TEM酶基因片段，检出率为 26.40%。在产ESBL大肠埃希菌中，其检出率为44.23%(23/52)，而在克雷伯菌属中检出率仅为12.76%(6/47)。这说明在西安地区TEM型酶主要在大肠埃希菌中流行。这与国内外文献报道的结果一致［3-4］。
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o_I 8c.a-flE7|2J S9F0 在125株ESBL阳性菌株中，有27株菌扩增出特异性SHV型酶基因片段。SHV型酶检出率为21.60%。在27株产SHV酶细菌中肺炎/产酸克雷伯菌21株，大肠埃希菌5株，阴沟肠杆菌1 株。产ESBL肺炎/产酸克雷伯菌中，SHV型酶检出率为44.68%，而在产ESBL大肠埃希菌中，检出率仅为9.62%。因此，在西安市产ESBL克雷伯菌属中，SHV酶比较流行，与文献报道的广州和台湾情况相同［5-6］。这种情况可能与SHV-1在肺炎克雷伯菌中广泛存在有关［3］。
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J"F+mF8G N _ 中国论文网J n-w ^9M#^ 在125株ESBL阳性菌株中，有49株菌扩增出特异性CTX-M型酶基因片段。CTX-M型酶的检出率为39.20%。因此，在西安地区产ESBL菌中，CTX-M型酶较为流行。这可能与本地区大量使用头孢噻肟和头孢曲松有一定的关系。产ESBL肺炎/产酸克雷伯菌中，CTX-M型酶检出率为 23.40%，而在产ESBL大肠埃希菌中，检出率仅为55.77%。此结果与文献报道的亚洲地区CTX-M型ESBL比较流行相符［6-7］，而且关于此型酶的流行国内其他地区报道也比较多［5,8］。
教育教学论文发表 中国论文网y4V`,L'p&B,in+p P"s6\Cw0 在我们研究的125株细菌中，有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。这与文献报道的多数产ESBL菌株同时携带2种以上β-内酰胺酶的结果相符［4-9］。另外，尚有38株细菌既没有扩增出SHV型酶基因，也没有扩增出CTX-M及TEM型酶基因。它们可能产生的是其他型ESBL。经过PCR只能对细菌产哪一型酶进行分析，并不能明确细菌产生的是哪一个酶。若要明确这一问题，还需对扩增产物纯化后进行碱基序列的分析。
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