【摘要】 目的 探讨在维吾尔族妇女宫颈癌组织中p16蛋白的表达和HPV(16/18型)感染的关系。方法 采用免疫组化S-P法和聚合酶链反应(PCR)技术检测34例正常宫颈组织(汉族19例，维吾尔族15例)以及40例宫颈癌组织(汉族18例，维吾尔族 22例)中p16蛋白的表达和HPV16/18的感染情况。结果 维吾尔族宫颈癌及正常宫颈组织中p16蛋白的阳性表达率与汉族相比均无统计学差异(P>0.05)；维吾尔族、汉族宫颈癌中p16蛋白的阳性表达率 (97.50%)明显高于维吾尔族、汉族正常宫颈组织(2.94%)(P<0.05)。HPV16型感染的宫颈癌中维吾尔族阳性表达率 (54.54%)高于汉族(22.22%)(P<0.05)；但HPV18型感染的宫颈癌无统计学意义(P>0.05)。维、汉宫颈癌组织中 p16蛋白表达量与HPV16型感染的相对表达量呈显著正相关性(r=0.603，P<0.05)。结论 p16蛋白和HPV联合检测可能作为检查宫颈癌的标记物，提高宫颈癌的检出率。
快速发表论文 中国论文网/I$_z D,Di0dA3I中国论文网#{(y#@T/j~ [【关键词】 宫颈癌；乳头状瘤病毒；p16；维吾尔族；免疫组化S-P法；PCR
中国论文网 {O"k~?n%? ABSTRACT: Objective To study the p16 protein expression in cervical cancer in Urghur women and its correlation with HPV16/18 infection. Methods The expression of P16 protein in normal and cervical cancer tissues was evaluated with S-P immunohistochemistry, whereas the infection of HPV was confirmed by PCR using specific primer sets for HPV16 or HPV18, respectively. Results There were no significant differences in the expression of p16 in either normal cervical tissues or cervical cancers between Urghur and Han nationalities (P>0.05). There were significant differences in the expression of p16 proteins in cervical cancers (97.50%) compared to the expression of those in normal cervical tissues (2.94%) both in Urghur and Han nationalities (P<0.05). The infection rate of HPV16 in the cervical cancer tissues from Urghur women was higher than that in Han women (54.54% in Urghur women and 22.22% in Han women, P<0.05). But the infection rate of HPV18 did not differ significantly in the cervical cancer tissues (P>0.05). Furthermore, there was a positive correlation between the expression of p16 and infection of HPV16 (r=0.603, P<0.05). Conclusion This study suggests that the detection of both p16 expression and HPV16 infection will improve the diagnosis rate of cervical cancer.
中国论文网 A d7i,wNI中国论文网!UO/W H@u'_(G.u7Y KEY WORDS: cervical cancer; HPV; p16; Urghur nationalities; immunohistochemistry; PCR
1GdVN!^c0中国论文网1iQ"V`D%S)D1M 子宫颈癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤。在我国少数民族中，新疆维吾尔族妇女宫颈癌发病率高，发病年龄早，诊断时临床期比较晚,其平均发病年龄约为45岁［1］。目前，普遍认为宫颈癌变与高危型人类乳头状病毒(16/18型HPV)的持续感染密切相关。马正海等［2］研究证明维吾尔族妇女宫颈癌中存在HPV16E6株的突变。p16基因产物是细胞周期依赖性激酶抑制物，参与了HPV感染引起的宫颈病变发展［3］。本研究采用了免疫组化S-P方法和聚合酶链反应检测34例正常宫颈组织和40例宫颈癌组织中HPV16/18的感染情况及p16的表达，探讨两者在维吾尔族妇女宫颈癌发生过程中的相互关系。现报道如下。
快速发表论文 plIq_Nv~0*Q[e-~9J6Qu&Q*n0 1 材料与方法
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h8{Z08NesR ^0M N\0 1.1 材料
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R{Mf+^0 收集2005-2006年间新疆医科大学第一附属医院正常宫颈组织34例，其中汉族19例，维吾尔族15例；宫颈癌40例，其中汉族18例，维吾尔族22例。
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J#X+_Nt.]9t rr+t Z0 1.2 试剂
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?0.YW ~l~+a#LT7VC i0 免疫组化所用试剂磷酸盐缓冲液(PBS)，柠檬酸抗原修复液，Monoclonal Antibody Anti-human p16INK4a/MTS1，即用型第二代免疫组化ElivisionTM plus 光谱试剂盒，DAB显色试剂盒均购于迈新公司。聚合酶链反应所用试剂蛋白酶K、PCR试剂、DEPC处理水、琼脂糖、100 bp DNA ladder Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；Tris碱、EDTA、5×TBE、1×TE、酚∶氯仿∶异戊醇(pH8.0)(25∶24∶1)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
Y v1OG0M#D V0中国论文网 ]3M$w;d|$Kc 1.3 免疫组化S-P方法
中国论文网8s2^ |X7t+f)z%{:wj(k2Y;q$H0 采用常规S-P免疫组化方法［4］。
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tg g3rq*L)B*t中国论文网&c4JeHQ5u 结果判断：用光学显微镜检查显色反应。光镜下组织细胞浆存在棕黄色颗粒为阳性。根据阳性细胞在组织中所占面积分为5个等级:<5%为(-)，10%-25%为(+)，25%-50%为(?)，50%-75%为(?)，>75%为(?)。
Sw0RIf](r0中国论文网3P |8AIJj 1.4 聚合酶链反应
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N}0中国论文网0Sb!W \ ^ 1.4.1 DNA的提取
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o&q;}K8f.c+` fr.q o!o^ |;D @F0 从经甲醛固定、石蜡包埋的组织中提取DNA(参阅：http://www.riedlab.nci.nih.gov/publications/DNA 20% Prep-ParaffinTiss.pdf.)［5］。
(A%T{"i+s3K"sa+{0中国论文网f [ U-A3L%Or 1.4.2 检测DNA大片段
中国论文网&Lu,ts{ [si1bz5?g4Pl?8e0 各模板取5 μL，以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Gel DocEQ凝胶成像仪观察，摄片并测A260/280定量，稀释为100 mg/L，-20 ℃贮存，备用。
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q$h0 1.4.3 DNA模板的纯化
GNr+h#iRV8d0 g9?-t?f+j A6S F0 将稀释模板放入UNIQ-10纯化柱中，8 000 r/min离心1 min，取过滤液，备用。
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]QC;?O9~ 1.4.4 PCR扩增的条件 HPV16型，引物A：5′-GGTCGGTGGACCGGTCGATG-3′；引物B：5′-GCAATGTAGGTGTATCTCCA-3′。 HPV18型，引物A：5′-CCTTGGACGTAAATTTTTGG-3′；引物B：5′CACGCACACGCTTGGCAGGT-3′。95 ℃预变性3 min，循环一次；95 ℃变性15 s，60 ℃退火(59 ℃退火，HPV18型)20 s，72 ℃延伸25 s，循环40次；72 ℃ 7 min，循环一次，4 ℃保存［6］。以上总反应体积为50 μL［TaKaRa Ex Taq(5 u/μL)0.3 μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus)5 μL、dNTP Mixture 4 μL、模板DNA 5 μL、引物1、2(20 nmol/L)2 μL，加DEPC处理水至50 μL］。
中国论文网8N3Y*c+r1p中国论文网,xD Q
iH$ix 1.5 统计学方法
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P 实验数据采用SPSS10.0软件进行处理，对计数资料用Fisher确切概率法及部分数据用χ2检验进行两组间率的比较和Spearman相关分析，检验水准α=0.05。
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fl 2 结果
L(e f;~ RG7u0中国论文网"l8\-_&ny 2.1 p16蛋白的表达
6w%\m R$Hr2IO0*A6~5@*F3~K7Q@8j)_0 p16阳性细胞胞浆呈棕黄色，少数细胞胞膜有较强烈的染色呈浆膜型，偶见细胞核染色。宫颈鳞癌组织中p16阳性细胞分布不一，呈巢状、灶性及散在分布，与周围阴性细胞对比明显。宫颈上皮内瘤样病变中的阳性细胞主要分布在基底细胞层，而正常宫颈组织中的阳性细胞则主要分布在中表层,基底细胞层呈散在分布(图1-图3)。
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g$^2q 2.2 HPV16/18感染
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z6\ 将PCR扩增产物在20 g/L(2%)的琼脂糖凝胶上电泳(100 V，10 min；60 V，1 h)，经Gel DocEQ凝胶成像仪(BIO-RAD)照相得到以下图片(图4、图5)。
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w9Zj 2.3 p16蛋白表达与HPV16/18型感染在正常宫颈及宫颈癌组织中的比较
h H~{.F(Kz/b0中国论文网7ivW8PjW U 在维、汉宫颈癌组织中p16蛋白阳性表达率(97.50%)明显高于正常宫颈组织(2.94%)，并有统计学意义 (P<0.05)；HPV16型感染的宫颈癌组织中维吾尔族阳性表达率(54.54%)高于汉族(22.22%)，并有统计学意义 (P<0.05)；维、汉宫颈癌组织中P16蛋白阳性表达与HPV16感染呈正相关性(r=0.603，P<0.05，表1)。另外，HPV18型感染在维、汉正常宫颈组织及宫颈癌组织中均无统计学意义(P>0.05，表2)。表1 正常宫颈及宫颈癌组织中p16蛋白的表达与HPV16的检测（略）表2 正常宫颈及宫颈癌组织中HPV18的检测（略）
快速发表论文 a q YJ/z k1r H0中国论文网 w)w8W n+k 3 讨 论
中国论文网1[P9zJPq中国论文网%F"^0l*lIj l p16蛋白是位于人类第9号染色体短臂上的多种肿瘤抑制基因(multiple tumor supressor, MTS)所编码的蛋白，系迄今所发现的第一个直接控制细胞增殖周期的固有蛋白。p16蛋白的作用途径是抑制细胞增殖和肿瘤发生的重要途径［7］。另据文献报道，p16蛋白在宫颈癌中的过表达与其基因突变和基因重排等的关系不大，但与p16基因启动区甲基化却有着密切的关系［8-9］。靳双玲等［10］、程淑霞等［11］和董磊等［12］报道，正常宫颈组织中p16蛋白的阳性率分别为12.5%(1/8)，6.67%(2/30)，0%(0/15)。 Murphy等［13］研究结果显示，正常宫颈组织中p16蛋白均为阴性，宫颈炎中p16蛋白阳性表达率(25%)明显低于宫颈癌(90%)。另外，p16蛋白在高危型人乳头状瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌标本均为高表达，在高危型HPV阴性宫颈癌标本或低危型HPV阳性宫颈癌标本均低表达或阴性。与本研究中正常宫颈组织中p16蛋白的低阳性表达结果相似2.94%(1/34)。本研究结果表明，维吾尔族宫颈癌与汉族宫颈癌的p16蛋白的表达无统计学差异，但维、汉宫颈癌组织中p16蛋白阳性的表达率(97.50%)明显高于维、汉正常宫颈组织(2.94%)(P<0.05)。
4t0yxf B;E0目前，已明确HPV16E6和E7蛋白能够绕过多种细胞周期负性因子的调控，包括p16蛋白介导的G1期细胞周期停滞，使细胞进入S期，导致遗传基因损伤，最终发展为肿瘤。据报道，在国外宫颈癌患者中HPV16的感染率为60.1%［14］，在我国的内蒙古地区HPV16在宫颈癌中的感染率为60.0% ［15］，63.4%［16］，而在新疆不同地区维吾尔族宫颈癌患者中HPV16检出率分别为72%［17］，77.6%［18］，84.61% ［19］，61.6%［20］。与本研究中新疆地区维吾尔族妇女宫颈癌中HPV16的感染率达54.54%(12/22)表达意义相似，并高于汉族妇女宫颈癌中HPV16的感染率22.22%(4/18)，有统计学意义(P<0.05)，而且维、汉宫颈癌组织中HPV16感染(40%)高于维、汉正常宫颈组织HPV感染(11.76%)。但是，被HPV18型感染的宫颈癌只有维吾尔族宫颈癌22例中的3例，汉族宫颈癌18例中无1例。这与本研究中所选宫颈癌标本大部分都是鳞癌可能有关［21］。
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o GD1@3@+Pq#Qs[0 宫颈癌前病变的演进与HR-HPV的持续感染有非常强烈的联系。Sano等［3］和Nakao等［22］研究认为p16蛋白在HPV感染阳性的子宫鳞癌中有很高的阳性表达率，而在HPV阴性的宫颈癌中，p16蛋白的表达率很低甚至没有。HPV16/18可以诱导p16蛋白的过度表达并使其具有永生性的特点，p16蛋白的过度表达可能直接或间接由HPV病毒编码蛋白E6和E7所诱导。它们可以与p53和pRB结合并使其活性下降最终导致宫颈覆盖上皮发生恶变。并且Kalof等［23］证实，p16蛋白表达和HR-HPV的检出率随着宫颈鳞状上皮内瘤样变的级别进展而增高、增强。本研究结果表明在16例HPV16的阳性的癌组织中，其p16蛋白的表达阳性率为100%。这也说明在 HPV16阳性的宫颈癌组织中，p16蛋白的阳性表达率是很高的。提示在宫颈病变中，HPV16型的感染与p16蛋白的表达呈正相关关系 (r=0.603，P<0.05)。Klaes等［24］用免疫组化的方法在48例宫颈炎组织中未检测出p16蛋白表达。Murphy等［12］检测了22例正常宫颈组织中的p16蛋白，结果均为阴性表达。而本研究中34例正常宫颈组织中33例p16蛋白阴性表达，1例阳性表达。分析其原因，该例标本可能存在HPV16/18型以外的其他高危HPV亚型的感染，并表达癌基因蛋白，也可能存在HPV以外的其他因素导致p16蛋白的表达。总之，p16蛋白和HPV联合检测可能作为检查宫颈癌的标记物，提高宫颈癌的检出率。
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