异丙酚对大鼠急性自体血栓肺栓塞的保护作用
2010年9月07日 16:06 作者:lunwenchina【摘要】 目的 观察异丙酚对急性自体血栓肺栓塞大鼠的保护作用及机制。方法 制备急性自体血栓肺栓塞模型，大鼠分为正常对照组、模型组、异丙酚低、中、高剂量组(4,8,16 mg·kg-1·h-1)。进行血气分析；检测肺系数、肺组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性；放射免疫法检测血液中内皮素（ET?1）、血栓烷素?2（TXB2）含量；RT?PCR和Western印迹方法检测肺表面活性蛋白?A（SP?A）mRNA及蛋白的表达。结果 异丙酚能升高血氧分压、血二氧化碳分压水平、SOD活性、SP?A mRNA和蛋白表达；降低肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量。结论 异丙酚对急性肺栓塞大鼠有保护作用。
【关键词】 异丙酚；肺栓塞；肺表面活性蛋白?A
急性肺栓塞是一种误诊率和病死率很高的疾病，且随着年龄增加其发病率和死亡率愈高〔1〕。异丙酚是一种较新型的静脉麻醉药物，在发挥麻醉效应的同时，因其静脉输入，可对全身组织产生不同的影响。已有研究表明异丙酚对急性肺栓塞有保护作用〔2〕，但在急性自体血栓肺栓塞中的作用研究不多，而自体血栓的形成和临床肺栓塞症血栓的形成具有一定的相似性，能更真实地反映疾病的病理生理改变，因此本文通过制备大鼠自体血栓急性肺栓塞模型来研究异丙酚对急性肺栓塞的作用并初步探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SD大鼠，清洁级，雄性，280～300 g，由河北省实验动物中心提供，异丙酚由四川蜀乐药业股份有限公司提供，肺表面活性蛋白?A（SP?A）引物由上海生工生物技术公司合成，抗SP?A单克隆抗体购自Sigma公司。
1.2 大鼠肺栓塞模型建立〔3〕
尾静脉取血0.2 ml，37℃水浴箱内过夜，次日分割成5 mm ×1 mm的栓子，放入2 ml的注射器内备用。大鼠用20%乌拉坦麻醉，颈正中切开，分离右侧颈总静脉，采用导管方法将混有15个血栓的2 ml生理盐水注入静脉。注入血栓后可见大鼠明显发绀，呼吸加快。
1.3 动物分组与给药
SD大鼠40只，随机分为正常对照组、模型组、异丙酚低剂量：4 mg·kg-1·h-1、异丙酚中剂量：8 mg·kg-1·h-1、异丙酚高剂量组：16 mg·kg-1·h-1。每组8只动物。除正常对照组外，各组注入栓子，异丙酚各组再分别继续输注异丙酚4、8、16 mg·kg-1·h-1(用5%葡萄糖稀释)4 h，模型组继续输注 5%葡萄糖2 ml/h。对照组颈静脉输注生理盐水。输注异丙酚 4 h时，腹主动脉取血处死动物。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 血气分析
各组实验动物于栓塞前、栓塞后、输注异丙酚后，分别颈总动脉取血作血气分析。
1.4.2 肺系数
仔细切除肺外支气管和脂肪组织，称肺重，计算肺系数=肺重/体重。
1.4.3 丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定
称取一块肺组织，匀浆，离心，取上清，按试剂盒的要求采用比色法测定。
1.4.4 内皮素?
1（ET?1）和血栓烷素?2（TXB2）含量测定 取全血，按说明采用放射免疫法测定。血栓素（TXA2）生物半衰期短，迅速代谢为稳定而基本无活性的TXB2，难以直接测定，国内外均以测定TXB2作为判断其浓度的指标。
1.4.5 肺组织形态学变化
常规苏木素?尹红（HE）染色。
1.4.6 大鼠肺组织肺表面活性蛋白（SP?A）mRNA及蛋白检测
1.4.6.1 RT?PCR方法检测SP?A mRNA表达
①提取肺组织总RNA；②进行逆转录；③PCR扩增SP?A目的片段，引物序列：SP?A 上游引物：5′?CCTTCACCCTCTTCTTGACTGT?3′，下游引物：5′?CAATGTTGCCTCCTGCTCTG?3′。β?actin上游引物：5′?CAGGGTGTGATGGTGGG?3′，下游引物：5′?GGAAGAGGATGCGGCAG?3′。 PCR条件为95℃ 5 min,预变性后，95℃ 30 s，58℃ 30 s,72℃ 30 s,25个循环后，72℃延伸5 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。β?actin作为内参照。
1.4.6.2 Western印迹法检测SP?A蛋白的表达
取肺组织提取蛋白质，定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，用抗SP?A单克隆抗体（1∶400）或β?actin单克隆抗体（1∶800）4℃孵育过夜，PBS漂洗三次后加二抗辣根过氧化酶（HRP)?IgG (1∶1 000)，室温孵育2 h，化学发光法显色，显色终止后在Labworks软件下对条带进行吸光度积分扫描。β?actin作为内参照。
1.5 统计学分析
数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA分析处理和Dunnet′t检验。
2 结 果
2.1 血气分析
栓塞后，各栓塞组血氧分压（PO2）和血二氧化碳分压（PCO2）明显下降，与正常对照组比较差异有显著性（P<0.05）。与模型组比较，PO2和PCO2均显著升高（P<0.05）。见表1。表1 异丙酚对急性肺栓塞大鼠血浆PO2和PCO2的影响(略)
2.2 大鼠肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量和 SOD活性的变化
与正常对照组比较，各组大鼠肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量均明显升高（P<0.05），SOD活性明显降低（P<0.05），与模型组比较，各组肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量均显著降低（P<0.05），SOD活性显著升高（P<0.05）。见表2。表2 异丙酚对急性肺栓塞大鼠肺系数、MDA、ET?1、TXB2 含量和SOD活性的影响(略)
2.3 形态学变化
肺栓塞后肺动脉血管内可见纤维性栓子，小动脉扩张充血明显，肺泡萎陷，肺间质水肿并可见多量红细胞漏出，异丙酚处理后病变程度明显减轻，正常对照组无上述病理变化。
2.4 SP?A蛋白及mRNA的变化
与正常对照组比较，各栓塞组SP?A蛋白及mRNA表达显著降低（P<0.05），与模型组比较，各组SP?A蛋白及mRNA表达显著升高（P<0.05）。见表3，图1、2。表3 异丙酚对急性肺栓塞大鼠肺组织SP?A mRNA及蛋白表达的影响(略)
3 讨 论
肺血栓栓塞明显的病理生理特征之一是气体交换异常，大量研究表明，肺血栓栓塞后血气变化结果为PO2、PCO2 同步下降〔4〕。Sofia等〔5〕通过监测肺栓塞患者动、静脉血浆ET水平、肾脏ET清除率证实：肺栓塞后动/静脉血浆ET放免活性比值升高，即肺脏合成/摄取ET指数增高，表明肺栓塞后有ET代谢异常。Garcia等〔6〕报道了肺栓塞后TXA2迅速升高，表明肺栓塞早期除由机械堵塞而引起肺动脉高压、肺血流减少外，TXA2导致的肺小动脉强烈收缩也起到了重要作用，并可能促进肺栓塞后血栓形成。
本实验中大鼠颈静脉注入自体血栓后，大鼠肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量均明显升高，SOD活性显著下降，同时，血气分析PO2和PCO2明显下降，显微镜下可见大量血栓，上述结果表明大鼠急性肺栓塞模型复制成功。
结果表明，与模型组比，异丙酚组均能降低肺系数、MDA、ET?1、TXB2含量，升高SOD活性，显著降低肺组织病变程度，提示异丙酚可降低肺部氧化应激反应,重建机体内氧化与抗氧化平衡,同时异丙酚通过使ET?1、TXB2含量下降，改善肺血流量，从而起到一定的保护作用。
SP?A为最先发现且在肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT?Ⅱ）中表达强烈、信号最为丰富的蛋白，它是肺表面活性物质的重要组成部分，有报道支气管肺泡灌洗液中SP?A是反映AT?Ⅱ功能受损的早期指标，也是判断肺损伤程度和预后的重要指标〔7〕，已有研究表明急性肺栓塞与SP?A含量降低密切相关〔8〕。Shannon等〔9〕研究表明，细胞骨架能稳定SP?A mRNA，如用细胞松弛素、秋水仙碱处理，SP?A mRNA的半衰期受到影响，SP?A合成量下降。本研究结果显示，大鼠急性肺栓塞后肺组织SP?A mRNA和蛋白表达均显著减弱，提示AT?Ⅱ细胞SP?A 的合成、分泌下降，因此，血栓引起AT?Ⅱ骨架结构的破坏可能是肺组织中SP?A mRNA、蛋白表达减弱的原因之一。给予异丙酚处理后，肺组织SP?A mRNA、蛋白表达均增加，提示异丙酚能使肺组织SP?A mRNA、蛋白水平升高，肺泡SP?A 合成增加、降解减少，减弱AT?Ⅱ的损伤程度，使AT?Ⅱ结构与功能得以改善。其详细作用机制尚有待于进一步深入研究。
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