甲状腺功能亢进肝阳上亢证大鼠下丘脑组织蛋白质差异表达的观察

【摘要】  目的 利用蛋白质组学方法,观察甲状腺功能亢进(简称“甲亢”)肝阳上亢证大鼠与正常大鼠下丘脑组织的双向凝胶蛋白图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法 左甲状腺素钠(L-T4)和附子汤灌胃造成甲亢肝阳上亢证模型,应用蛋白质组学技术比较模型组与正常组中下丘脑的差异蛋白质,结合生物信息学对其进行分析鉴定。结果 两组蛋白斑点总体分布相似,主要分布在等电点pI 3～8,分子量Mr 14.4～75 kD；分析发现,模型组与正常组相比有18个蛋白质上调和24个蛋白质下调,进一步质谱鉴定,其中7个蛋白质分别为NSFL1 辅助因子、硫氧还蛋白、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、血小板活化因子乙酰基水解酶IB-γ亚单位、谷氨酸脱氢酶前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2和微管蛋白。结论 模型组与正常组相比,有18个蛋白质点上调,有24个蛋白质点下调,经质谱鉴定了其中部分蛋白质。蛋白质的变化可能与甲亢肝阳上亢证的形成密切相关。
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【关键词】  甲状腺功能亢进；肝阳上亢证；下丘脑；蛋白质组学；动物模型
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        Observation of Differential Protein of Hypothalamus in the Hyperthyroidism Rats with Hyperactivity of Liver-Yang  ZHOU Ling-yan, CHEN Ze-qi, LI Wei, et al (Chinese Traditional and Westenr Modern Medicine Research Institute of Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China    Abstract：Objective Utilization of proteome method, by observing differences on protein expression of hypothalamus in the hyperthyroidism rats with hyperactivity of liver-yang and normal rats, to search the differential protein. Methods Models of animal were prepared by ip L-T4 and Fuzi Decoction. Both the quantitative and qualitative changes of the protein expression were compared between model group and treated group by protein technique. Results Proteins were mainly displayed at range of pI 3～8, Mr (14.4～75)kD. 18 protein increased and 24 protein decreased in model group compared with treated group, included Thioredoxin, Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, Platelet-activating factor acetylhydrolase IB gamma subunit, glutamate dehydrogenase, dihydropyrimidinase-related protein 2, NSFL1 cofactor p47, Tubulin beta 5. Conclusion There were 18 spots high expressed and 24 spots low expressed in the hyperthyroidism with hyperactivity of liver-yang, that maybe related with the     甲状腺功能亢进(简称“甲亢”)是由于多种病因引起甲状腺激素分泌过多,而导致基础代谢增加、自主神经功能失常、甲状腺肿大等为特征的常见内分泌疾病。在中医学中,甲亢属于瘿病范畴,早在公元前3世纪,就已有关于瘿病的记载。目前,临床上各医家对甲亢的辨证分型各不相同,但大多数认为肝阳上亢证为甲亢常见证型[1-2]。由于甲状腺功能主要受下丘脑、垂体的调节,因此,笔者拟应用蛋白质组学技术,通过观察甲亢肝阳上亢证大鼠与正常大鼠下丘脑组织蛋白质双向凝胶图谱,以期寻找差异表达的蛋白质。
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1  实验材料
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1.1  动物    正常SD(sprague dawley)大鼠20只,雌雄各半,8周龄,体重(190±10)g,中南大学湘雅医院实验动物学部提供。1.2  药物    附子汤：由60 g单味制附子(由中南大学湘雅医院中药房提供)组成,将药物浸泡30 min,煎煮2次后再将药液合并,浓缩为含原药材0.2 g/mL。中国论文网4grz&LH4U5Yx


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b w${&s:[)O!L0　　1.3  试剂
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SohB"r0    2-D Quant Kit蛋白质定量试剂盒、固相pH梯度干胶条(IPGstrip pH3-10L,24 cm)、IPG缓冲液(pH3-10L)、覆盖液均由Amershan Biosciences公司提供；二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素(urea)、甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、考马斯亮蓝、琼脂糖均由Sigma公司提供；低分子量标准蛋白质由上海伯奥生物制品公司提供；硫酸氨、磷酸、无水甲醇、无水乙醇均由湖南师范大学试剂厂提供。
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　　1.4  仪器中国论文网U*{;d2B4S
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    Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪, Ettan DALTⅡSystem垂直电泳槽(Amersham公司),Imagescanner扫描仪(Sigma公司),PDQest 7.0分析软件(Bio-Rad公司),Elx800自动酶标仪(Bil-Tek Instru-ments, Inc),Applied Biosystems Voyager- DE STR BiospectrometryTM work statior System 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪(ABI公司提供)。发表论文网站 中国论文网5q3?oxS(E#REx
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　　2  实验方法
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eB:P(\j0　　2.1  甲亢肝阳上亢证模型的复制
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a+ipW)Z0　　将大鼠随机分为正常组和模型组(各10只)。正常组不做任何处理,每天进行正常饮食。模型组参照文献[3-4]方法,予附子汤,10 mL/(kg·d)灌胃,相当于原药材2 g/(kg·d),共3周,第11天开始将左甲状腺素钠(L-T4)1 mg/(kg·d)体重灌胃,连续10 d,造成甲亢肝阳上亢证大鼠模型。模型复制成功的标准参照鄢氏等[3]的方法,包括一般情况和用放射免疫法测T3、T4；其中一般情况有大鼠的外观、性情变化、肛温和饮水量的变化(于造模前、后各观察1次)。
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　　2.2  标本的准备
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5d]t3tr9U'J,e'MZ0    所有动物在处死前均从腹腔注射麻醉剂(10%水合氯醛,2 mg/kg),待动物麻醉后在洁净的冰台上取出下丘脑。迅速将下丘脑用冰生理盐水冲洗干净,装在标记好的冻存管中液氮保存备用。
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　　2.3  组织蛋白质的提取及浓度测定中国论文网f{&bze%fL%a_ i
  
,K {'\!|;u[xI0　　将处理过的标本从液氮罐中取出,置于研磨管,加入组织裂解液0.2 mL(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,2% NP-40,1% Triton X-100,100 mmol/L DTT,5 mmol/L PMSF,4% CHAPS,0.5 mmol/L EDTA,40 mmol/L Tris,2% pharmalyte)研磨,静置1 h,12 000 r/min 4 ℃离心60 min,取5 μL上清用于2-D Quant Kit蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度,其余上清液冻存于-80 ℃备用。
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　　2.4  固相pH梯度双向凝胶电泳和考马斯亮蓝染色
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　　①第一向固相pH梯度等电聚焦EPG-DALT,按IPGphorTM等电聚焦系统指南进行。组织总蛋白质提取物(含蛋白质800 μg)与水化液及IPG缓冲液pH 3～10,2.25 μL充分混合,总体积450 μL,加入IPG持胶槽,将IPG干胶条去保护膜胶面朝下,置入持胶槽中,覆盖一层矿物油,盖好持胶槽盖子,置于IPGphor等电聚焦仪的电极板上。水化和聚焦在20 ℃自动进行,总电压时间积为70 020 Vh,其中水化在30 V低电压进行14 h,然后经过100 V中国论文网*]
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1 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,最后稳定在8 000 V下进行。②平衡：等电聚焦结束后,迅速取出带样品的IPG胶条,分别于20 mL平衡液A和平衡液B中各平衡15 min。③第二向垂直板SDS-PAGE电泳：将平衡后IPG的胶条移至0.75 mm厚的12.5%丙烯酰胺胶的上端,并在其酸性端的外侧加上低分子量标准蛋白质Marker,排净气泡后用0.5%琼脂糖封闭。先设置恒功率2.5 W/块胶电泳30 min,后改为恒功率15 W/块胶电泳,直至溴酚蓝到达距胶底边约1 cm处停止电泳。将经过第二向垂直板SDS-PAGE电泳的12.5%丙烯酰胺胶从制胶板中分离出来,用双蒸水洗3次、5 min/次；再加入考染液(250 mL/块胶),水平摇床上染色过夜。
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})P{(Z._.U+Y&c6r0　　2.5  凝胶图像分析中国论文网u8v Gjg[?"w
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    凝胶通过Imagescanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描,获取图像；利用PDQuest 7.0分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析。所有数据的统计分析在SPSS 12.0软件和Excel上进行。中国论文网mM,Pj-Ho
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　　2.6  质谱样本准备,质谱分析和数据库查询
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　　随机选取表达有显著差别的10个蛋白质点,参照文献[5]方法进行蛋白质的原位酶解,将制备好的点样板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDI-TOF-MS仪上进行分析,采用反射模式,正离子谱测定,离子源加速电压为20 000 V,反射电压比为1.12,N2激光波长337 nm,脉冲宽度为3 ns,离子延迟提取100 ns,真空度4×10-7Torr,质谱信号单次扫描累加50次,质谱使用胰蛋白酶自动降解峰作为内部校正,获得了肽质量指纹图。通过因特网在ExPASY的PeptIdent软件中进行搜寻,寻找与参数相匹配的蛋白质。中国论文网b#gHN1Z*d v*p

H8cB2N/P K,[3G0　　2.7  统计学方法发表论文网站 中国论文网Cu;`,qG-F
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    实验数据以x±s表示,采用SPSS12.0统计软件对实验结果进行t检验处理。
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x9_(t'\ c2jv0　　3  结果
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　　3.1  甲亢肝阳上亢证模型的复制结果中国论文网/[%IWq7]f
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　　造模成功后,模型组毛色逐渐失去光泽,眼结膜均有不同程度的充血变红,易激惹；而正常组大鼠毛色光泽,双眼灵活有神,眼结膜未见明显充血变红；模型组大鼠的饮水量及肛温明显高于正常组,2组有显著性差异,如表1、2所示。2组大鼠于处死时分别心脏取血3 mL,用放免法测T3、T4。结果见表1～表3。表1  2组大鼠造模前后饮水量比较(略)注：与本组造模前比较,*P<0.01；与正常组比较,△P<0.05,△△P<0.01(下同)。表2  2组大鼠造模前后肛温比较(略)表3  2组大鼠T3、T4值比较(略)中国论文网gK&}8g(p#e_#y

x!K[xj$]"m0　　3.2  双向凝胶电泳结果中国论文网9oI9k?H#Uj\
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    在相同条件下,将2组大鼠的下丘脑分别进行了3次2D电泳,如图1、图2所示。两者总蛋白的分布模式非常相似,蛋白质点主要分布在pI3～8和Mr14.4～75 kD范围,经PDQest 7.0分析软件分析,在相同条件下识别的蛋白质点个数分别为正常组(764±30)个、模型组(755±28)个。图像分析时将正常组下丘脑的凝胶选为参考胶,利用软件进行匹配,并结合肉眼观察,与模型组相比较。通过比较分析,模型组中蛋白质点表达上调的点有18个,下调的点有24个。
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　　3.3  质谱结果中国论文网v_#Dq!F
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    在有显著差异的蛋白质点中选取10个点进行质谱分析和数据库查询,搜寻到7个有意义的蛋白质。
A5G0Aja4CI-lDoW"`0　4  讨论
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Q&`hWK t3J0    目前,临床上各医家对甲亢的辨证分型各不相同,但大多数认为肝阳上亢证为甲亢常见证型。目前,已有多项研究表明：肝阳上亢证与外周交感-肾上腺髓质系统功能活动增强、血浆肾上腺素和去甲肾上腺素含量增高有关[6-7],且去甲肾上腺素有显著促进体外培养甲状腺细胞的生长作用[8]。由于甲状腺功能主要受下丘脑、垂体的调节,因此,本实验采用病证结合的方式复制动物模型,采用双向凝胶电泳分离甲亢肝阳上亢证与正常大鼠下丘脑的总蛋白质,了解它们的表达情况。经过严格的同一条件下的2D电泳、图像处理、软件分析、背景消减、条纹祛除、斑点检测、斑点匹配等,模型组与正常组比较,模型组中蛋白质点表达上调的点有18个,下调的点有24个,然后通过质谱技术和蛋白质数据库比较,进一步鉴定其中的部分蛋白质。本研究结果显示,模型组较正常组上调的有NSFL1辅助因子；下调的有硫氧还蛋白(Trx)、泛素羧基末端水解酶同工酶L1(UCH-L1)、血小板活化因子乙酰基水解酶IB-r亚单位、谷氨酸脱氢酶前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2和微管蛋白B-5。
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xJ-R$Z6J(P:f0　　Trx是一个广泛分布的氧化还原蛋白,分子量约为12 kD,根据存在位置不同分为Trx1(细胞质和细胞核)和Trx2(线粒体)两型。Trx通过二硫化物活性中心可逆地催化许多氧化还原反应,参与机体多种生物学活性,调节机体的氧化还原、细胞凋亡与增殖,与人类某些疾病,如肿瘤、AIDS、自身免疫性疾病、神经系统疾病、感染性疾病、遗传性疾病和动脉硬化等发生、发展有关[9]。Trx还能激活核转录因子kB(NF-kB)及其相关的信号传导通路[10]。本研究发现模型组中Trx表达上调,可能与甲亢高代谢而致组织氧化还原不平衡有关。
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"g)XL|%Lf0　　UCH-L1属于泛素系统,除泛素外还包括4种酶家族,它们是泛素活化酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶和去泛素酶,是体内蛋白降解通路之一,同时也参与体内细胞调控[11]。UCH-L1是去泛素酶中的一种硫基蛋白酶,识别和水解结合在泛素羧基末端甘氨酸残基的短肽及聚泛素链,使泛素游离或成为可重复利用的泛素。有文献报道,在脑干死亡的过程中UCH-L1可能起到了至关重要的作用[12]。UCH-L1的缺乏可能与某些神经系统疾病有关[13]。目前尚无UCH-L1与甲亢或肝阳上亢证相关的文献报道,本研究发现UCH-L1在模型组中表达下调,其机制是否与甲亢及肝阳上亢证的形成有关还有待进一步深入研究。发表论文网站 中国论文网-jt[*B;D&@$^
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　　微管是细胞骨架成分之一,在细胞分裂、运动、信号转导等方面起着重要作用。微管蛋白属于微管蛋白家族,与体内细胞的形态结构变化和细胞的增殖、运动密切相关[14]。它能够结合两个GTP分子,一个结合在beta链的可替换位点,另一个则结合在alpha链的不可替换位点。由微管蛋白聚集而成的微管是组成纺锤体的主要部分,抑制其聚集将导致细胞有丝分裂终止。本实验中模型组微管蛋白beta5表达下调,可能影响到下丘脑组织细胞的分裂活动,进而引起甲亢肝阳上亢证有关的神经症状,还有待于进一步证实。
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