As2O3诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡和端粒酶活性的关系

【摘要】  目的 探讨As2O3诱导HO8910细胞凋亡和端粒酶活性变化的关系。方法 用不同浓度的As2O3溶液作用卵巢癌细胞株HO8910，于不同时间点收集细胞，MTT法检测细胞生长抑制率；FCM检测细胞凋亡率；TRAP-银染法观察端粒酶活性的变化。结果 As2O3溶液对HO8910有生长抑制和诱导凋亡的作用，与药物浓度和作用时间相关。不同浓度As2O3作用HO8910细胞，其端粒酶活性在24 h无明显改变，随着作用时间的延长，端粒酶活性逐渐下降，随着药物浓度的升高端粒酶活性也呈不断下降趋势，以致消失。结论 As2O3可以诱导卵巢癌细胞株HO8910发生凋亡，其机制可能不是通过端粒酶活性下降直接调控的，但端粒酶调控与凋亡调控有一定相关性。怎么发表论文
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|&P+N;I| U0【关键词】  三氧化二砷；人卵巢癌细胞；细胞凋亡；端粒酶活性
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　　ABSTRACT: Objective  To explore the relationship between the variation of telomerase activity and apoptosis by arsenic trioxide in ovarian carcinoma cell line HO8910. Methods  We collected HO8910 cells at 24 h, 48 h and 72 h respectively under different concentrations of As2O3. The inhibition rates of cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay to evaluate the effect of As2O3. The percentage of apoptosis was detected by flow cytometry (FCM). Telomerase activity of ovarian carcinoma cells was determined by the method of TRAP-PAGE argentation. Results  Growth inhibition and apoptosis induction were evoked by different concentrations of As2O3 in HO8910 cells in a time- and concentration-dependent manner. Within 24 h, the telomerase activity of HO8910 cells had no obvious change in different concentrations of As2O3. The telomerase activity gradually decreased till vanished with the prolongation of time and increase of concentrations. Conclusion  As2O3 can induce HO8910 cells apoptosis. Apoptosis induced by arsenic trioxide may not be directly regulated through the decrease of telomerase activity. However, correlation exists between telomerase and apoptosis regulation.
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3A:oarM3c3Y0　　KEY WORDS: arsenic trioxide; human ovarian neoplasm; apoptosis; telomerase activity
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d0　　三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)是中药砒霜中提取的有效成份，已有实验研究表明As2O3具有抗肿瘤作用。端粒酶的激活对细胞的永生化起到非常重要的作用，抑制端粒酶的活性为临床抗肿瘤治疗提供了一条新思路。As2O3诱导的细胞凋亡与端粒酶活性之间是否存在某种联系，迄今报道不一。我们采用细胞培养、MTT法、流式细胞仪检测、TRAP-银染法等先进的技术，探索As2O3诱导卵巢癌细胞凋亡的机制以及细胞凋亡与端粒酶活性之间的关系。中国论文网G&F6s Z^#R}6E
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　　1  材料与方法中国论文网;g"s'`{$pp O3KQ

#Y2l7\9qik/\_-des0　　1.1  材料与引物 中国论文网 oET^e"Q1|+w:a
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　　人卵巢浆液性囊腺癌细胞株HO8910由第四军医大学妇产科实验室惠赠。人宫颈癌Hela细胞购自西安交通大学第一附属医院泌尿外科实验室，人胚肺成纤维细胞HFL-I购自中国科学院上海细胞所。As2O3为哈尔滨伊达药业公司产品，配制成15 mmol/L As2O3储存液，过滤除菌后，-20 ℃保存。使用前用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释至工作浓度。DMEM培养基为美国GIBCO公司产品。Annexin Ⅴ-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司。CHAPS购于Sigma 公司。TaqDNA 多聚酶购于Promega 公司。RNasin购自华美生物工程公司。
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　　引物设计与合成：由上海生物工程公司合成，引物序列为TS引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；NT引物：5′ -ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3′；ACX引物：5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′；
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k|+H0TSNT引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3′。怎么发表论文
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:i)k4X3ye0　　1.2  方法
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　　1.2.1  细胞培养
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8fr}%T#\b8@0　　三种细胞常规培养在高糖型DMEM培养基中，培养条件为37 ℃，50 mL/L CO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5 g/L胰酶消化成单个细胞继续传代。
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2_-E&tVg,p:nn%v P3T0　　1.2.2  活细胞观察 中国论文网8VQ N1\,h3m;Y
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　　按1×105/mL细胞悬液接种HO8910细胞于50 mL培养瓶中，分为实验组和对照组，实验组细胞用不同浓度As2O3处理，于处理24、48、72 h后用倒置显微镜观察实验组和对照组细胞的形态变化。
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oR9Ji&`gV+j0　　1.2.3  MTT法测定细胞生长抑制率 中国论文网.\)u/W tJQ0Z6o)Ur
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　　取对数生长期HO8910细胞，按6×103/孔的密度接种于96孔培养板，24 h后，实验组分别加入As2O3溶液使其终浓度达到工作浓度，每个浓度组设3个复孔，以加入不含药物的细胞培养液组为空白对照组，将各组细胞继续培养 24、48、72 h后，以MTT法测定活细胞数，取3孔均值。细胞的生长抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100%，重复上述实验5次，取其均值。中国论文网h8V'ju ~n

qu*j4d)Q,z#I0　　1.2.4  流式细胞仪定量检测细胞凋亡率
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l0}*{^M)]'`,n0　　将含5×105/mL细胞数的HO8910细胞悬液接种于50 mL培养瓶中，细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的As2O3，平行对照组不加药物，于24、48、72 h后，收集各浓度组的HO8910细胞，制备成单细胞悬液，用4 ℃预冷的PBS(pH7.4)洗涤2遍，用250 μL结合缓冲液(binding buffer)重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/mL，取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin Ⅴ/FITC和10 μL 20 mg/L的碘化丙锭(propidium iodide)溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加300 μL结合缓冲液(binding buffer)，流式细胞仪检测，测试完毕用ModiFit软件进行数据分析。实验重复4次。中国论文网,a{ u!L$Rd0]

?pG1RZ{_E0　　1.2.5  TRAP-银染法半定量检测端粒酶活性 中国论文网0@H3w'y_@+g/h
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　　取对数生长期HO8910细胞悬液8 mL(106个细胞)接种于100 mL培养瓶中，贴壁后加入不同浓度的As2O3溶液，24、48、72 h后，细胞刮刀刮下细胞，加入洗液混悬，倒入无菌试管内，离心1 000 r/min×5 min，弃上清加入200 μL CHAPS裂解液，40 u RNAsin，混悬后转入无RNase的匀浆器匀浆，冰浴30 min，4 ℃离心，12 000 r/min×20 min，取上清，采用标准Bradford法测定提取物蛋白质含量，取提取物加入10×TRAP缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，TS引物、NT引物及ACX引物各0.1 μg(混合物总体积1 μL)，无RNase H2O补至48.6 μL，混匀，37 ℃水浴30 min；94 ℃ 3 min，灭活端粒酶；加入TSNT引物0.01amol/L(1 μL)；置PCR循环仪进行扩增反应，循环参数：94 ℃ 40 s；50 ℃ 40 s；72 ℃ 40 s，25个循环。取15 μL PCR扩增产物，进行120 g/L(12%)非变性聚丙酰胺电泳，银染后观察。以Hela细胞为阳性对照，HFL-I细胞作为阴性对照。怎么发表论文中国论文网5H*d`?n7t RG/{K

Z5h`/o4Zex&`%w]5Z0　　1.3  统计学方法
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　　计量资料采用(x±s)表示，生长抑制率的比较采用重复测量数据的方差分析；SPSS12.0统计软件数据处理，P<0.05表示有显著性差异。中国论文网g#eaM&a}~9iM:F
2  结果
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　　2.1  活细胞观察
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TH+\ L.EFY!@2@0　　HO8910细胞倒置相差显微镜下观察为贴壁生长，胞浆饱满，生长舒展，颜色透亮，随着As2O3浓度的增加和作用时间的延长，HO8910细胞变小、变圆，境界模糊，核固缩出现，核染色加深，折光性增强，细胞脱落，悬浮于培养基中(图1)。中国论文网BNi!~$Ld.S
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　　2.2  MTT法测定As2O3对HO8910细胞的增殖抑制作用
na6ywr1Q@R*EI0　　MTT法检测As2O3对HO8910细胞作用不同时间的生长抑制效应见图2(生长抑制曲线)，在1.5 μmol/L As2O3时对HO8910细胞的生长没有明显抑制作用；随着药物浓度的增加以及作用时间的延长，细胞的生长抑制作用增强，在48 h之前观察到各个浓度组的As2O3对HO8910细胞的生长抑制率为负值，统计学分析显示，没有显著性差异(P>0.05)，在72 h时，3.0、6.0、15、30 μmol/L浓度组出现明显的生长抑制效应，且各组之间有显著性差异(P<0.05)。
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0Y;u |Z(jIB0　　2.3  双参数流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化 怎么发表论文中国论文网 ZNxLb ra(S
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　　同样依照MTT实验结果：选择6.0 μmol/L As2O3作用于HO8910细胞24、48、72 h，均有细胞凋亡现象，且随着时间的延长凋亡率增多。平行对照组：24、48 h未见明显凋亡，72 h早期凋亡率3.38%，晚期凋亡率1.51%，总凋亡率为4.89%。实验组：24 h凋亡率为6.93%，早期凋亡率3.25%，晚期凋亡率3.68%；48 h凋亡率为11.28%，早期凋亡率7.36%，晚期凋亡率3.91%；72 h凋亡率为22.39%，早期凋亡率10.81%，晚期凋亡率11.48%。另外，又选择了15 μmol/L As2O3浓度组作为比较。我们可以观察到，随着作用时间的延长和药物浓度的增加细胞凋亡率明显增多，表明As2O3诱导HO8910细胞凋亡具有时间和浓度依赖性关系(图3)。
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F7^a@v"Rq4H:vb8`E0　　2.4  TRAP-银染法检测端粒酶活性的变化 中国论文网Kl1K&q,]
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　　分别用不同浓度的As2O3处理人卵巢癌细胞株HO8910，1.5 μmol/L As2O3浓度组处理癌细胞在各时间点的端粒酶活性表达均为阳性；各浓度组的As2O3作用24 h时HO8910端粒酶活性未见明显抑制。3.0 μmol/L As2O3浓度组作用卵巢癌细胞株HO8910 72 h后端粒酶活性下降，表现为该浓度组的梯形条带染色与阳性对照相比变淡，6.0 μmol/L浓度组的梯形条带更淡，15 μmol/L浓度组在72 h的梯形条带基本消失，表明这个浓度组的端粒酶活性完全抑制(图4、图5)。中国论文网(w"}*iV/m7M
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　　3  讨论
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#Q \@Xq5M4o0    目前，As2O3已经被认为是一种安全有效且低毒的药物，已成功应用于急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)及复发性APL的临床治疗。同时，发现As2O3对肝癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤细胞也有抑制增殖和诱导凋亡的作用。我们前期的实验也证实，As2O3 对人卵巢癌细胞株SKOV3和COC1也有抑制增殖和诱导凋亡的作用［1］。通过G1期阻滞是诱导其凋亡的可能机制之一。本实验结果显示，As2O3可以诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡。
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/x"y`]7t_q0　　As2O3诱导细胞凋亡的机制，经典观点认为是通过线粒体依赖途径发挥作用的。早期出现线粒体通透性改变、膜电位降低、细胞色素C及AIF释放，引发Caspase-9激活及Caspase级联反应［2-3］。
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　　端粒酶(telomerase)为核糖核酸蛋白复合体，主要由3个亚单位组成，即端粒酶相关蛋白、端粒酶RNA及其催化亚单位hTERT(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)。研究表明，端粒酶RNA和TP1广泛存在于各类细胞中，而hTERT仅存在于端粒酶阳性细胞中，端粒酶活性与hTERT mRNA表达水平密切相关，端粒酶以自身RNA为模板合成端粒DNA加到染色体末端上，稳定并保持端粒长度。马学斌等［4］研究发现As2O3可引起 Hela细胞周期阻滞，hTERT mRNA的表达水平下调，端粒酶活性降低，进而细胞凋亡。有研究表明［5］，低剂量的砷增加端粒酶的活性，维持或延长端粒的长度，而高剂量的砷降低端粒酶的活性，使端粒缩短和诱导凋亡。
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　　As2O3可以通过抑制肿瘤细胞端粒酶的活性而快速诱导细胞凋亡，认为端粒酶活性改变可能是激发细胞凋亡的机制之一，端粒酶活性的抑制是细胞凋亡级联反应中的早期事件［6-9］。也有作者报道As2O3可能通过破坏非端粒酶依赖性端粒维持途径机制，引起端粒酶活性是阴性的肿瘤细胞端粒的缩短，从而诱导了凋亡。也有相反的观点认为，端粒酶调控和凋亡调控无关。本文结果表明，As2O3作用 HO8910细胞24 h有凋亡现象。但是，未见端粒酶活性的改变，48 h端粒酶活性轻度下降，72 h端粒酶活性显著抑制，此时凋亡细胞数最多。本实验结果显示，As2O3诱导肿瘤细胞凋亡可能不是通过端粒酶活性下降直接调控的。关于As2O3诱导肿瘤细胞凋亡的机制，端粒酶调控和凋亡调控的关系尚需通过信号传导途径进一步研究。怎么发表论文中国论文网 N;~:n9U3UdWr7@X
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