皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1mRNA表达及意义

【摘要】  目的： 检测活动期皮肌炎(dermatomyositis，DM)患者外周血CD4+T细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）以及血清磷酸肌酸激酶（CK）含量。初步探讨CD4+T细胞TGF?β1在皮肌炎发病机制中的作用。方法： 收集12例活动期皮肌炎患者和12例健康对照者外周血，采用免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞，通过RT?PCR方法检测出各组TGF?β1表达水平。观察CD4+T细胞中TGF?β1表达与CK含量的相关性。结果： 活动期皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1相对表达量为0.751±0.107，显著高于健康对照0.438±0.170﹙P<0.05﹚。CD4+T细胞TGF?β1表达量与CK含量呈中度正相关﹙r=0.67, P<0.05﹚。结论： 活动性皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1 mRNA表达显著升高，可能与皮肌炎疾病发生有关。 中国论文发表中国论文网.c2WA/Q(h L8Q'\

【关键词】  皮肌炎 CD4 T细胞 ?β1中国论文网7uV+Oz&`-plhE

~)N9k'pFvI0    ［Abstract］  Objective: To investigate the expression of trans?forming growth factor?β1 (TGF?β1)mRNA in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis (DM)patients in active stage, and explore the association with serum creatinkinase levels. Methods： CD4+T cells from peripheral blood were isolated by microbeads，and TGF?β1 mRNA was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT?PCR).  Results： The expression of TGF?β1 was significantly higher in CD4+ T cells from the dermatomyositis  patients than those from healthy control group (0.751±0.107 vs 0.438±0.170，P<0.05﹚. There was positive correlation between the expression levels of TGF?β1 mRNA and serum creatinkinase levels（r=0.67，P<0.05﹚. Conclusion： TGF?β1 was significantly higher in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis patients. TGF?β1 may play a role in the damage of DM.中国论文网1m6D4`
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    ［Key words］  dermatomyositis；CD4+ T cells；TGF?β1中国论文网J,@EMj`Z

    皮肌炎(dermatomyositis，DM)是一组亚急性或慢性起病、免疫介导的自身免疫性疾病, 主要表现为对称性的肢体近端无力、肌肉疼痛、肌酶明显升高，同时伴有以眶周为中心的紫红色水肿性斑、Gottron氏征等特征性皮肤损害。组织病理学特点为肌组织内炎细胞浸润与肌纤维坏死［1］。其病因及发病机制目前尚不完全清楚, 但近年来在皮肌炎患者受累皮肤和肌肉活检中发现大量活化的CD4+T细胞浸润，CD4+/CD8+比值为2.5［2］。转化生长因子β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）是人体多种组织细胞的生长调控因子，对细胞外间质表达、基质降解、细胞增殖分化和细胞凋亡功能等有明确的作用。并且，TGF?β1还具有较强的免疫调节作用。本研究通过检测皮肌炎患者外周血CD4+T细胞TGF?β1 mRNA的表达，同时与患者血清CK含量进行相关性分析,探讨其在皮肌炎发病机制中的作用。中国论文发表中国论文网y1J+aq%]r n#G

    1  对象与方法

4vqVbe9i6X`E^0    1.1  研究对象　中国论文网6w%j]#J/Ci
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GNgTG.a:mX0    12例活动期皮肌炎患者选自2007年6月～2008年2月江苏大学附属医院风湿科、皮肤科门诊及住院患者，其中男5例，女7例，年龄40～65岁，平均51.6岁。病程2个月～3年，平均2.15年。诊断依据为1975年Bohan的诊断标准［3］,剔除合并肿瘤及重叠综合征患者。以临床表现、补体降低、肌酶、血沉升高以及肌电图改变综合判断疾病的活动性。检测前,患者至少3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。选用单位体检正常者为健康对照组，其中男5例，女7例，年龄41～66岁，平均51.2岁。中国论文网^Pi.Pf

    1.2  主要试剂与仪器 中国论文网1X%U3rG+n1h#s

    Trizol试剂(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Toyobo公司)；水平电泳槽(Bio?Rad公司)；凝胶电泳图像分析仪(Syngene公司)；免疫磁珠(Miltenyi公司)。中国论文网*b3l!Y?J Y6]~

{ M2U3^9g&r,[ y.L0    1.3  细胞分离

i3\"Xr2ED sq'`w0    收集患者和健康对照者静脉血10 ml，肝素抗凝，通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离出CD4+T细胞，细胞纯度大于92%。

5V)?nvV.JA0    1.4  RT?PCR中国论文网2E!w"|)EC @

FZ b8T;QkM*T,h,]-i0    按常规方法提取总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA后-20℃贮存备用。根据基因库中公布的基因序列，通过Primer Premier 5.0 软件设计PCR特异性引物，聚合酶链反应引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列为：β?actin上游引物5′?CACGAAACTACCTTCAACTCC3′，下游引物5′?CATACTCCTGCTTGCTGATC3′，扩增产物262 bp；TGF?β1上游引物5′?GCTCCTGTGACAGCAGGGAT3′，下游引物5′ ?GGCAGAAGTTGGCATGGTAG3′，扩增产物303 bp。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃（β?actin）或54℃（ TGF?β1 ）退火，72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸7 min。中国论文网-@k,JY6iH#g'~

    1.5  PCR产物分析及半定量计算

    PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，计算CD4+T细胞TGF?β1和β?actin条带密度比值（TGF?β1/β?actin）作为TGF?β1的相对表达强度。

.H ^z^8so0    1.6  统计学分析中国论文网zSH2x@$m F

XTMB/L2F5V$N0    所有数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。两变量的相关程度采用直线相关分析法。中国论文发表中国论文网?$^W'Z"Yg

    2  结  果

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P?0    2.1  活动性皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1 mRNA表达水平检测结果

    健康对照（n=12）和皮肌炎患者（n=12）CD4+T细胞TGF?β1的相对表达强度分别为0.438±0.170和0.751±0.107，经检验t=5.38，P<0.01。见图1。中国论文网kI-kj+FaWc:y gA

q8c;d ]+v$qh0    2.2  活动期皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1 mRNA表达水平与血清CK含量相关性分析 中国论文网*\6o:S AKQ

%`iGb0hEm!QbP0    活动期皮肌炎患者CD4+T细胞与血清CK含量的相关系数为r=0.67，P<0.05，呈中度正相关。见图2。中国论文发表

    3  讨  论中国论文网0ZZvitQ
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    研究认为皮肌炎是由于日光辐射、微生物感染、外伤等诱因致使易感人群发生自身免疫紊乱并导致皮肤、横纹肌为主等器官损伤的一种结缔组织疾病。皮肌炎患者肌内膜及其血管周围存在大量以活化的CD4+T淋巴细胞为主，部分B细胞以及巨噬细胞参与的单个核细胞群的浸润［4］。近来研究发现皮损组织中Th淋巴细胞介导的炎症，微血管损害和角质形成细胞的凋亡失调是疾病发生的重要机制。中国论文网*V$aA'\0j!d

    TGF?β1是一类具有双向调节功能的生长因子，主要由活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞合成和分泌，某些肿瘤细胞、成骨细胞以及内皮细胞也可产生，TGF?β1能趋化巨噬细胞和成纤维细胞，促进血管生成，从而在创伤修复中起重要作用。TGF?β1也具有促进和抑制免疫的双向调节功能。根据不同的表达量发挥不同的效应。对TGF?β1基因敲除小鼠的研究发现［5］，肌肉组织中TGF?β1在正常表达情况下具有抗炎作用。然而当TGF?β1过度表达时，促进炎症发生并可导致肌内膜纤维化。此作用可能与TGF?β1刺激自身肌肉组织结缔组织生长因子的表达有关。CTGF能促进成纤维细胞增殖迁移, 细胞外基质形成［6］。在Duchenne 肌营养不良病中发现肌组织中TGF?β1 mRNA表达明显增高。Amemiya等［7］对5例皮肌炎患者采用大剂量静脉滴注免疫球蛋白治疗，对治疗前后患者肌活检比较后发现，临床症状和组织学改善的同时TGF?β1表达也显著下降。中国论文网0x B9i W8_ G"Lz

8wY$hYVe3`Yt'r0    本次实验结果显示，皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1表达明显高于健康对照组。皮肌炎患者血清CK均值为（2503.42±1344.05）U/L，较正常值（0～200 U/L）显著增高，与TGF?β1表达呈中度正相关。提示TGF?β1可能是导致皮肌炎肌肉损害的原因之一。患者中有5例伴有肺间质病变，肺纤维化，1例伴甲状腺瘤，1例伴甲状腺功能减退；5例肺间质病变、肺纤维化患者TGF?β1表达尤为增高，均高于0.80；可能与TGF?β1具促进成纤维细胞增殖致纤维化有关。此外，TGF?β1还对早期肿瘤有抑制作用，进展期促进肿瘤浸润、转移［8］。皮肌炎患者特别是部分老年患者常伴随肿瘤的发生。本次实验中并未发现伴有肿瘤的患者，可能与所选病例病程较短以及样本数量少、患者以中年为主有关。要进一步了解TGF?β1在皮肌炎发病机制中的作用还需要增加病例作进一步研究。中国论文发表中国论文网M
N qZ8@ cT/X:tV

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