肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响

【摘要】  　　目的 观察肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响，探索多器官功能障碍综合征的新的防治途径。方法 SD大鼠45只，随机分为3组：正常对照组、肠缺血-再灌注损伤模型组、肠功能恢复汤治疗组，分别检测各组血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量，收集小肠灌洗液并测定灌洗液中的溶菌酶含量，同时取肠系膜静脉血、肠系膜淋巴结、肝及脾组织进行细菌培养，观察细菌移位情况，取回肠组织制成石蜡切片，HE染色光镜下观察，测量小肠黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度，取回肠组织制成电镜标本，透射电镜观察。结果 肠功能恢复汤组与模型组相比，血清中DAO和D-乳酸含量均显著降低(P<0.01)，小肠灌洗液中溶菌酶含量显著升高(P<0.01)，细菌移位率显著降低(P<0.01)。肠功能恢复汤组小肠黏膜的病理形态明显好于模型组。结论 肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠的肠黏膜屏障具有保护作用。怎么发表论文 中国论文网 g[zns HSg
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【关键词】  肠功能恢复汤 肠缺血-再灌注损伤 肠黏膜屏障
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oG0　　ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of the decoction to help recover intestinal function on the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury. Methods  Forty-five SD rats were divided into three groups randomly: control group, gut ischemia-reperfusion injury group and decoction group. We detected the content of DAO and D-lactate in serum and lysozyme in perfusate of intestine in each group. We observed the bacteria translocation, the change of ileum mucous membrane in pathomorphology and intestinal villi. Results  Compared with those in gut ischemia-reperfusion injury group, the contents of DAO and D-lactate and bacteria translocation ratio were all lower in decoction group (P<0.01), but the content of lysozyme in perfusate was higher (P<0.01). The ileum mucous membranes in decoction group were better than in gut ischemia-reperfusion injury group in pathomorphology. Conclusion  The decoction to help recover intestinal function can protect the intestinal mucosal barrier of rats with gut ischemia-reperfusion injury from damage.
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hWL4IMh#O8A0　　KEY WORDS: decoction to help recover intestinal function; gut ischemia-reperfusion injury; intestinal mucosal barrier中国论文网#S [ sx}
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　　大量研究显示肠道活跃参与创伤、烧伤和感染后的各种应激反应，是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)发生的始动器官［1-2］。肠缺血-再灌注损伤是肠黏膜屏障破坏的基本因素之一。肠功能恢复汤由大黄、丹参等10余味中药组成，具有促进肠蠕动，促进术后肠功能恢复及肠道营养吸收等作用，其对肠道黏膜屏障是否具有保护作用，目前尚未见相关报道。本实验通过观察肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障的影响，探索MODS新的防治途径。怎么发表论文 中国论文网 hab!m,w6ul.{
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　　1  材料与方法
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　　1.1  材料
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　　SD大鼠45只，SPF级，雌雄不限，体重(248.3±16.3)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。T6型新世纪紫外光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；超速离心机(北京医用离心机厂)；RM2025型组织切片机 (德国LEICA公司)；Olympus光学显微镜(日本)；H-600型透射电镜(日本日立公司)；VIDAS-21型自动图像分析仪(德国 OPTON)；DAO标准品、邻联二茵香胺购自美国Sigma公司；D-乳酸标准品、D-乳酸脱氢酶购自南京凯基生物发展有限公司；溶菌酶购自中科院生物物理所生化厂，溶壁微球菌由西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系提供。中国论文网#l _3{dR
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　　肠功能恢复汤：大黄20 g(后下)、丹参12 g、党参15 g、白术15 g、陈皮15 g、木香12 g、桃仁12 g、赤芍15 g、火麻仁30 g、枳实12 g等组成，由西安交通大学医学院第一附属医院中药制剂科提供，浓缩煎制成浓度为1∶1药液(含生药1 g/mL)，灭菌处理后4 ℃冰箱内保存。
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)GoB(It2g0　　1.2  肠缺血-再灌注损伤动物模型［3］的建立 怎么发表论文
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jIq~V-X [0　　大鼠于造模前24 h禁食，自由饮水。称重后给予腹腔注射100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，实验台上仰卧固定，腹部脱毛后常规消毒铺无菌巾，取腹部正中切口进腹，暴露肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)，各组分别用无创夹夹闭其根部45 min，松夹即为再灌注。
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　　1.3  动物分组 中国论文网+~8H(d%Ih[ t W
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　　45只大鼠随机分为3组，正常对照组(control group)15只：正常大鼠生理盐水灌胃；肠缺血-再灌注损伤模型组(I/R group)15只：造模后 ，生理盐水灌胃；肠功能恢复汤治疗组(decoction group)15只：造模后即给予肠功能恢复汤灌胃；均为1 mL/100 g，2次/日，连续2日。中国论文网.U%Bgo"?
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Y$xL/^J)E-XN:l0　　1.4  血清二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量的测定中国论文网t8Y y9Yw1r7I@BJ kK

k,g]!?r0　　各组动物于造模成功48 h后，用100 mL/L水合氯醛(30 mg/100 g)麻醉，严格无菌操作下采取门静脉血，采用黎君友等［4］的分光光度法测定血清DAO活性；采用Brandt等［5］的分光光度法测定血清D-乳酸含量，均严格按说明书操作。中国论文网)SSHeY#p,Qv

Z&}Yv6J;if0　　1.5  小肠灌洗液中溶菌酶含量的测定 中国论文网WC%N8Iq6H&j
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　　麻醉后立即剖腹切取从屈氏韧带到距回盲部5 cm处的肠管，用生理盐水洗去浆膜上的污物，然后以100 mL/L乙酸50 mL灌洗小肠，将小肠灌洗液在4 ℃，5 000 r/min，离心30 min，收集上清液装入透析袋，透析18 h除去乙酸以及其他小分子物质，然后冷冻干燥，得到小肠灌洗液乙酸溶解物，用琼脂平板扩散法测其溶菌酶的含量。
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dN(N0　　1.6  细菌培养 中国论文网)I\\Iy.z#Zny-L

$J;[j/Y&l3p0　　麻醉后，无菌条件下打开腹腔，分别取肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)、肝及脾组织各0.5 g，加入生理盐水1 mL制成匀浆，取匀浆液0.5 mL，接种于直径10 cm中国兰培养基平皿内，同时取肠系膜上静脉血0.5 mL加入血培养基中作细菌培养，37 ℃条件下孵育48 h，如果培养基平皿菌落数多于100个/g组织记为细菌培养阳性，细菌移位率按细菌培养的阳性脏器数/培养脏器总数计算。
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,]t$O-fb_q4X0　　1.7  小肠黏膜病理形态学观察和小肠绒毛高度的测量
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r:r&ZDUCK,u}0　　麻醉后于距盲肠5 cm处取回肠组织，100 mL/L甲醛固定，石蜡包埋切片，行HE染色，光镜观察。每只动物选取一张石蜡切片，在病理图像分析仪上进行黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度的测量。于距盲肠5 cm处取回肠组织约0.5 cm，用生理盐水冲洗管腔，将肠管纵向剪开，浆膜面向下铺于无水滤纸上，将组织切成1 mm×3 mm之组织块，置于3 mL/L戊二醛溶液中固定24 h，10 g/L四氧化锇固定，梯度乙醇及丙酮脱水，Epon802树脂包埋，超薄切片包埋、切片，醋酸铀，枸橼酸铅染色，透射电镜观察。
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aLY*GY*l0　　1.8  统计学处理
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　　试验数据以均数±标准差( ±s)表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，两组间进行均数差别比较的t检验，细菌移位率采用Fisher确切概率法进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
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B+Z2e%?-u%y/x|0　　2  结果
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5oV&_}+S0　　2.1  各组大鼠一般情况、死亡率和腹水情况的比较正常对照组动物外观、活动及各项体征均表现正常，于标本采集前全部存活，开腹后未见腹水。模型组动物表现为皱毛、腹泻、活动减少、反应迟钝、体重减轻和体温下降。另外，尚有呼吸窘迫、足尾潮红、口唇发绀、稀便，部分动物口鼻有粉红色泡沫状液体溢出等表现，死亡率为33.33%，开腹后可见比较多的清亮腹水。肠功能恢复汤组大鼠的一般情况好于模型组，死亡率为26.67%，开腹后可见少量清亮腹水。
r'Cy/^!_3R7de:b.x02.2  各组大鼠血清DAO和D-乳酸含量的比较 中国论文网)m.ch*_/p)}
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　　正常对照组大鼠血清中DAO和D-乳酸含量很低，而肠功能恢复汤组与模型组两项指标均升高，与模型组相比，肠功能恢复汤组DAO和D-乳酸含量均显著降低(P<0.01，表1)。
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　　2.3  各组大鼠小肠灌洗液中溶菌酶含量的比较 中国论文网*U'p'd)s2|

*xjN.R?oLl0B0　　肠功能恢复汤组与模型组相比，小肠灌洗液中溶菌酶含量显著升高(P<0.01，表1)。表1  各组大鼠血清DAO、D-乳酸和小肠灌洗液中溶菌酶含量的比较（略）中国论文网)U1vtC0|$[
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?e o,r&DS,hp'Lf0　　2.4  各组大鼠细菌移位情况的比较
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l_G2V+Uh|0　　正常对照组大鼠仅在肠系膜淋巴结中培养出细菌；模型组细菌移位率最高，为87.50%；肠功能恢复汤组细菌移位率为43.18%，与模型组相比，细菌移位率显著下降(P<0.01，表2)。表2  各组大鼠细菌移位情况的比较（略）
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　　2.5  各组大鼠肠黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度的比较中国论文网{v2|!G'rT5ht.v
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　　模型组小肠明显萎缩，肠壁变薄，肠腺显著减少，分布密度降低，肠绒毛短而稀疏。肠功能恢复汤组结果明显好于模型组(P<0.01，表3)。表3  小肠黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度的比较（略）中国论文网V9hZwV*A

Oi3}1[:S&U8@r5{Y0　　2.6  各组大鼠回肠组织的病理学改变
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　　光镜下显示：对照组黏膜结构正常(图1A)，模型组回肠黏膜上皮细胞水肿、坏死、部分脱落、绒毛损伤断裂，炎细胞浸润(图1B)，肠功能恢复汤组的病理形态优于模型组(图1C)。电镜下显示：模型组小肠上皮细胞排列紊乱，微绒毛稀疏脱失，线粒体内质网空泡变性，紧密连接不清(图2A-2D)。肠功能恢复汤组小肠上皮排列稍紊乱，有轻微微绒毛脱失，线粒体内质网空泡变性，但紧密连接较明显(图2E-2H)。
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W3N@bR3i hgtk;e#M0　　3  讨 论
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　　肠黏膜屏障主要由机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障组成［6］，可以防止肠腔内细菌及内毒素通过肠壁到达肠外器官，但在创伤、感染及应激等情况下，机体通过神经-内分泌适应性反应可引起肠黏膜屏障的损害，导致肠道通透性增加和细菌、内毒素移位，引起机体重要脏器损伤，并可导致多器官功能障碍综合征(MODS)［7］。因此，在MODS的防治过程中应十分注意保护肠黏膜屏障。中国论文网&N!zIJ}"P}-?4l)ul9h
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　　肠功能恢复汤由大黄等10余味中药组成，大黄导热泻下，火麻仁润肠通便，枳实行气破结，白术、陈皮健脾和胃，党参益气补中，丹参活血通经，桃仁、赤芍活血化淤，木香行气。在我院已有三十余年的临床应用，具有促进肠蠕动，促进术后胃肠道功能恢复及肠道营养吸收等作用。
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　　本研究显示，肠缺血-再灌注损伤大鼠血清DAO、D-乳酸含量显著上升。DAO是哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞质中活性较高的细胞内酶。当肠黏膜屏障受损时，胞内释放增加，血中活性升高。D-乳酸是细菌发酵的代谢产物。当肠黏膜屏障受损时，肠道中细菌产生的D-乳酸通过受损肠黏膜经循环入血，使血中D-乳酸水平升高。可见，肠缺血-再灌注损伤大鼠的肠黏膜被破坏，通透性增大。与模型组相比，肠功能恢复汤治疗组的血清DAO、D-乳酸含量显著下降，回肠黏膜的病理形态、小肠黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度等也较好。提示肠功能恢复汤可以有效地保护小肠黏膜，维持肠黏膜的物理屏障和正常的通透性。此外，肠功能恢复汤治疗组小肠灌洗液中溶菌酶含量比对照组和模型组都显著升高，提示肠功能恢复汤亦能刺激肠道内溶菌酶的分泌。本研究还显示，正常大鼠仅有极少肠系膜淋巴结培养出细菌，模型组肠系膜淋巴结细菌检出率为100%，血清、肝、肾组织中均有很高的细菌检出率。可见，发生肠缺血-再灌注损伤时有广泛的组织器官细菌移位。肠功能恢复汤治疗组的细菌移位率显著下降，提示肠功能恢复汤能在肠缺血-再灌注损伤时一定程度上抑制细菌的移位。
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　　因此，肠功能恢复汤对肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障具有保护作用，其机制可能为：①保护肠黏膜物理屏障，维持肠黏膜正常的通透性；②促进胃肠道蠕动，加速了肠内毒素的排出，同时抑制了细菌的定植。从而减轻了细菌和内毒素对肠道的损害。肠功能恢复汤中的大黄、火麻仁、枳实、白术、党参、丹参、桃仁、木香等［8］有促进胃肠道蠕动，抑制细菌生长，扩张胃肠道血管，改善微循环和促纤溶，抗血栓形成的作用。刘瑞林等［9］的研究显示：大黄的主要成分之一大黄素可抑制过度炎症反应，减轻中性粒细胞聚集及活化, 减少大鼠氧自由基的生成，从而起到保护肠黏膜的作用。③抑制了肠内菌群生态平衡紊乱；④扩张胃肠道血管、改善微循环，减轻了肠黏膜缺血再灌注损伤。据大量文献报道［10］丹参不仅能清除氧自由基和抗脂质氧化、升高体内SOD含量，还具有抗血小板聚集和抗血栓形成，减轻器官缺血-再灌注损伤的作用。怎么发表论文 中国论文网&N;Y;Af;K%~3z
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　　综上所述，肠功能恢复汤能保护肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障，其具体的作用机制尚需进一步深入研究。中国论文网:t.Sf:k'g |
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