【摘要】 目的 通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和耳蜗中活性氧含量研究咪唑安定对噪声性聋的保护作用。方法 雄性杂色豚鼠40只，随机分为正常对照组(C组)、咪唑安定组(M组)、生理盐水组(S组)和噪声性聋组(D组)，每组10只。M组、S组和D组每天接触倍频程连续噪声(中心频率为4kHz，强度为100dB SPL)3h，连续3d。M组于噪声暴露前24h、即刻及噪声暴露中肌肉注射咪唑安定0.1mg/kg；S组在相同时间肌肉注射等量的生理盐水；D组为单纯接触噪声对照组。C组不接触噪声仅肌肉注射咪唑安定，注射时间及剂量与M组相同。所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即检测听性脑干反应(ABR)阈值，在噪声暴露前和噪声暴露第3天处死前，取血测定血清中SOD活性、MDA含量，于第3天测完ABR阈值后，立即断头处死豚鼠，取出双侧耳蜗，测定其活性氧含量。结果 噪声暴露后，M组的ABR阈移(1.6±1.5)及活性氧含量[(291.10±2.30)u/mL]显著低于S组和D组 [41.7±3.3，44.3±3.9；(348.52±3.60)u/mL，(315.56±6.70)u/mL， P<0.05]。M组在噪声暴露后血清SOD活性下降、MDA含量升高，但其幅度明显小于S组和D组。结论 咪唑安定可减少噪声暴露后耳蜗中增多的活性氧含量，从而产生对噪声性耳蜗损伤的保护作用。
代发表职称论文 ez5FjXA r0'a#B5R#e5B @ s0【关键词】 耳蜗；活性氧；噪声性聋；咪唑安定
中国论文网*UZ!s*l1w"t$L ? \中国论文网oG8}5?`n U/X ChinaABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of midazolam on noise-induced hearing loss in guinea pigs by testing reactive oxygen species (ROS) level in the cochlea and plasma SOD and MDA. Methods Totally forty male pigmented guinea pigs were randomly divided into four groups: control (C) , midazolam (M), normal saline (S) and noise-induced deafened (D) groups, with ten guinea pigs in each. Groups M, S and D were exposed to a continuous noise (4kHz , octave band, 100dB SPL) 3h every day for 3 consecutive days. Group M was treated with midazolam, which was administered intramuscularly (0.1mg/kg) 24h before noise exposure, and immediately upon and during noise exposure. Group S was exposed to noise and treated with the same volume of normal saline intramuscularly, the time of injection was the same as that of Group M. Group C was not exposed to noise, but was treated with midazolam intramuscularly, the time of injection and the dosage were the same as those of Group M. Group S was exposed to noise and treated with normal saline intramuscularly ,the time of injection was same with that of Group M.Group D was exposed to noise only. All animals received auditory brainstem response (ABR) threshold recording before and immediately after noise exposure. Blood was collected when the guinea pigs were killed after the last ABR threshold recording, and serum SOD activity and MDA content were detected. Both the cochleae were removed and prepared for ROS assay. Results After noise exposure, ABR threshold shift (1.6±1.5) and ROS content [(291.10±2.30)u/mL] in Group M were significantly lower than those in Groups S and D [41.7±3.3, 44.3±3.9; (348.52±3.60)u/mL, (315.56±6.70)u/mL, P<0.05]. Serum SOD activity and MDA content were significantly increased in Group M, but the amplitude was less than that in Groups S and D.
代发表职称论文 %g7B
b Z,x H5@)B e0中国论文网9os1N$a6_.v9V KEY WORDS: cochlea; reactive oxygen species (ROS); noise-induced hearing loss; midazolam
中国论文网1tx M Uj K b&TM"\8yX Xs"O [)pU0Qg/r1t0 随着现代医学的发展，医用电钻在耳科手术中应用越来越广泛，但耳科电钻噪声引起的内耳听力损伤仍未引起足够的重视。早在1976年KYLEN和ARLINGER通过人的颞骨和尸体颅骨研究证实耳科电钻在术侧耳蜗的噪声为100dB，这种噪声可以导致高频感音神经性听力下降。噪声可对人的听觉系统产生特异的损伤作用，导致听阈升高，严重的则引起噪声性聋。噪声对听觉系统的损伤除造成代谢性损伤外，同时产生机械损伤，两者均导致大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，ROS在噪声引起的耳蜗损害中起着十分重要的作用[1]。ROS清除剂能减轻噪声引起的听力损害[2]。CHUNG[3]研究表明,全身麻醉药异氟醚、氟烷、戊巴比妥能够对小鼠噪声引起的听力损害起到保护作用，推测其机制可能与活性氧的产生减少有关。本研究通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和耳蜗中ROS含量来研究咪唑安定对噪声性聋的防护作用及其可能作用机制。
代发表职称论文 中国论文网4Ba+_-wU*Q%JRFB'U^3l.?
|hw,~6i f0 1 材料与方法
中国论文网/Z-i~2Y2mxv8Re ynH_0 1.1 实验动物及分组
k([
T6PxO;Nlv0中国论文网&gC0Up#t:Z
d 选用耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠40只，体重250～300g，随机分为正常对照组(C组)、咪唑安定组(M组)、生理盐水组(S组)和噪声性聋组(D组)，每组10只。正常对照组不接触噪声，只注射咪唑安定；咪唑安定组接受噪声暴露且注射咪唑安定；生理盐水组接受噪声暴露，注射生理盐水；噪声性聋组单纯接触噪声。
代发表职称论文 &U%Xs'` oI#dK0W
l O \o0 1.2 噪声条件
中国论文网y$f.L$h ?)E[~ _中国论文网's
W&@;{k4ikts[ 自制噪声箱，为自由声场的混响箱，背景噪声<40dB SPL(A)。采用特制动物笼，将每只豚鼠分隔开。噪声箱的两个对角有两个扬声器，特制动物笼放置在两个扬声器之间，与每个扬声器的距离约为40cm。扬声器与纯音听力计相连(丹麦产DANPLEXDA74)，由纯音听力计发出中心频率为4kHz的倍频程连续噪声，校准后强度为100dB SPL，且使每只动物所在位置噪声基本一致。咪唑安定组、生理盐水组和噪声性聋组动物每天给与3h连续噪声，持续3d。正常对照组不接触噪声。
:ZM {8z3Qc&X ~0中国论文网C:S%t&B g*c1A 1.3 给药方法
[cOy?$}2PK9w0中国论文网2l
_7~1i#gUC 咪唑安定组于噪声暴露前24h、噪声暴露前即刻及噪声暴露中1h肌肉注射咪唑安定0.1mg/kg(购自江苏恩华药业有限公司)。正常对照组给予注射咪唑安定，其时间与剂量同咪唑安定组；生理盐水组在相同时间肌肉注射等体积的生理盐水。
中国论文网[ l.C\n1t:r Z中国论文网 YO'[.E@'A$Pf ql 1.4 听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)阈测试
中国论文网^x W;p)W p;p中国论文网)pC
zWMI!OZ 所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即测ABR阈值(丹麦产Keypoint)。10g/L氯胺酮(0.5mg/kg)腹腔注射麻醉后，将气导耳机紧贴豚鼠耳廓，分别测定左右耳，记录电极置于豚鼠颅顶，参考电极置于刺激侧耳垂，地线绑于足部。刺激声为短声(click)，强度范围为0～120dB SPL，重复率为19.4次/min，平均叠加次数1000次，滤波带宽100～5000Hz。每只豚鼠以能引出明确的可重复III波的最小刺激声压级作为阈值。
d%Y"?x)M%W,^T8p"Q0x-o.t#UB0 1.5 血清SOD活性和MDA含量测定
中国论文网Q&a|,u^3h,J3z {$l|W2[0 在噪声暴露前和噪声暴露第3天处死前，取豚鼠血约1mL，3000r/min离心30min，取血清-80℃冻存，待测。使用MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，按操作说明测定血清SOD活性和MDA含量。
代发表职称论文 中国论文网
U
U_ t3r i rmly2B-R9R0 1.6 耳蜗组织ROS含量的测定
中国论文网{ ^L3g
j"@3D M/O2GTm,t0 噪声暴露第3天ABR测试后，立即将所有豚鼠断头处死。迅速取出双侧听泡，置于4℃ PBS液中，在显微镜下去除蜗壳，取出基底膜连带蜗轴，立即置液氮中，24h后于-80℃冰箱保存，用于耳蜗组织ROS含量的测定。豚鼠断头处死到将耳蜗组织液氮冷冻的时间平均为15min，每只之间相差不超过3min。
中国论文网SF/PE#Q7F中国论文网!@ \)Q1M vQ!_ 1.6.1 耳蜗组织匀浆液的制备
中国论文网 t9KN h(}%Q(O中国论文网 |.f8gc9w5J W^!s o~ 自-80℃冰箱取出保存的豚鼠双侧耳蜗，置于微型玻璃匀浆器中，先加入0.5mL匀浆介质，于冰上研磨15min后倒入1mL的EP管中，再用0.5mL匀浆介质冲洗玻璃匀浆器后倒入EP管中，于低温、4000r/min离心15min，取上清用于ROS含量的测定。
中国论文网J AB)f*w0p!b7b1.6.2 耳蜗组织ROS含量测定
jU:A7Y6P|
e6]!R0q#i
L s PtT nC:p0 使用ROS测定试剂盒测定(南京建成生物工程研究所提供)。最佳取样量定为2%，抑制率为21.35%，符合抑制率在20%～50%的要求。将耳蜗组织匀浆用生理盐水稀释成20mL/L，取0.2mL测定。
.u0H U;_3fg`,l_e0中国论文网C6mh!T#QD7g 1.7 统计学处理
V#?(f'^)dE9a j |0
n.wRwO B `p0 数据处理应用SPSS13.0 统计软件包，所有数据经过正态性检验符合正态分布，数据以±s表示。噪声暴露前后组内比较采用配对t检验分析，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有显著性。
`d4K9R-|eg0中国论文网n4~P Mb!T 2 结 果
'}~ zy"N0]6h0 SF)B l;mr r&Q N0 2.1 各组ABR阈移
中国论文网"bImajE中国论文网,mQ
_S#n4e 噪声暴露前，4组ABR阈值之间比较均无显著性差异(P>0.05)。
,jhve;[;G@8G qn0SM N$|+R n1|0 正常对照组和咪唑安定组动物噪声暴露后与噪声暴露前ABR阈值无显著性差异(P>0.05)，而生理盐水组、噪声性聋组噪声暴露后ABR阈值明显高于噪声暴露前(P<0.01)。噪声暴露后，咪唑安定组的ABR阈移明显低于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.01)，正常对照组的ABR阈移也显著低于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.01)。正常对照组和咪唑安定组之间、生理盐水组和噪声性聋组之间ABR阈移的差异均无显著性 (P>0.05，表1)。表1 各组豚鼠的ABR阈移（略）与噪声暴露前比较，*P<0.01；与咪唑安定组比较，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01。
代发表职称论文 中国论文网 dB B\o h中国论文网2R&T k0hj5jVmY0X 2.2 血清SOD活性和MDA含量变化
F o)ICQP|.td"?q+w03x%dct$]'@0 生理盐水组和噪声性聋组在噪声暴露后血清SOD活性明显下降(P<0.05)，血清MDA含量则显著增高(P<0.01)。咪唑安定组在噪声暴露后同样出现血清SOD活性下降和MDA含量升高，但其幅度明显小于生理盐水组和噪声性聋组(P<0.05)。正常对照组血清SOD活性和MDA含量没有明显变化(表2、表3)。表2 各组豚鼠血清SOD活性的变化（略）与噪声暴露前比较，*P<0.05, **P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05；与噪声性聋组比较，△P<0.05。表3 各组豚鼠血清MDA含量的变化（略）与噪声暴露前比较，**P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05；与噪声性聋组比较，△P<0.05。
中国论文网6y,q.va`*eL;Z中国论文网T'N1as;G
h1| 2.3 各组豚鼠耳蜗ROS含量的变化
u_(o(W
CQ.v"t04E `
P va2B\Z@0 咪唑安定组的ROS含量低于生理盐水组和噪声性聋组，正常对照组的ROS含量也低于生理盐水组(P<0.05)。正常对照组和噪声性聋组之间、生理盐水组和噪声性聋组之间ROS含量比较无显著性差异(P>0.05，表4)。表4 各组豚鼠耳蜗ROS含量（略）与咪唑安定组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05。
中国论文网HK{"Af5y"q0B"v2p+{(`0tS qM0 3 讨 论
8q:w5k p#uq0中国论文网v$\-O ND#|hT8N$L ROS指生物体内氧的某些代谢产物及其衍生的含氧的自由基。需氧生物体内均可产生活性氧，其具有独特的生理作用。细胞有许多抗氧化机制，可以分为酶类和非酶类物质。酶类物质包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)；非酶类物质有很多，包括维生素C、谷胱甘肽(GSH)、维生素E和甘露醇等。正常人体内ROS的产生与CAT、GSH-Px、SOD等保护酶构成的内源性防御系统维持着动态平衡。只有当ROS的产生与防御系统的一系列酶的清除作用失衡，ROS的产生超过了机体的防御能力时，才会对机体造成损害。
中国论文网]f-g eW.R7F#Mhh f?1_3@LH+X0frB X0 噪声性聋的机制是一个复杂的多因素过程,研究认为包括机械性、代谢性和血管性原因。耳蜗是有氧代谢非常旺盛的器官，产生大量ROS，容易受到ROS的氧化损伤。声音的过分刺激能导致酶和代谢产物在毛细胞中的再氧化，产生活性氧产物。噪声可造成氧自由基对组织的损伤,直接破坏细胞膜成分,还可通过生物膜及亚细胞器损伤,在末梢组织造成广泛损害。脂质过氧化物还可抑制前列腺素(PGI2)的合成,引起血管收缩和凝血,进一步加重内耳缺血,致组织细胞变性坏死 [4]。近几年来，已有利用维生素E与维生素C的抗氧化机制来预防噪声性聋的相关报道[5-6]。
中国论文网;q} h4g v*E中国论文网 Wu M]?(j`j|R 自由基对细胞的损害在于攻击细胞膜脂质产生过氧化反应，MDA则是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化的程度，间接反映细胞受自由基攻击和损伤的程度。体内自由基的清除依靠SOD等抗氧化酶系统，测定SOD活性可反映组织抗脂质过氧化能力。
中国论文网7kB&r+b;L F{y中国论文网SFT9V i,Z5q-d8X 咪唑安定作为一种新型的非巴比妥类静脉麻醉药已广泛应用于临床。咪唑安定除了具有麻醉镇静作用外，由于其结构上与内源性抗氧化物维生素E相近，在生物体中作为供氢体与自由基反应生成苯氧基而清除自由基，具有一定的抗氧化作用。其抑制自由基介导的脂质过氧化作用可能是主要的抗氧化机制[7]。吴新文等[8] 研究发现临床剂量的丙泊酚和咪唑安定具有清除自由基的作用，增加机体抗氧化能力。咪唑安定能降低组织细胞代谢率[9] ，经肝微粒体羟化作用而代谢，可消除体内的·OH，可使由·OH引发的脂质过氧化反应减轻。
中国论文网0rfw)cU ^ Dr8UO/z}/f Ssy0 本实验发现噪声暴露后豚鼠血清氧自由基反应代谢产物MDA含量明显升高，提示噪声环境下豚鼠血中自由基生成增加，势必影响到耳蜗组织中MDA含量，豚鼠听力受损程度与自由基对内耳的氧化损伤密切相关。同时，咪唑安定组血清SOD活性高于生理盐水组和噪声性聋组，说明咪唑安定可减少氧自由基生成，提高SOD活力，对自由基氧化引起的听力损害有预防和治疗作用。
8n0J1G$U` Y9U0中国论文网5e \ rSyS7E
Hx;H"{r ABR是反映听功能的一项客观指标。本实验的噪声条件可以使听阈提高40dB左右。由本研究结果可看出，长时间的强烈噪声暴露可引起听阈提高；而注射咪唑安定可起到防止听阈提高的作用，注射生理盐水对噪声性聋无预防作用。通过对耳蜗中ROS含量测定，证明咪唑安定有一定的抗氧化活性，可以抵抗体内过多的 ROS，对噪声性聋起到预防作用；生理盐水无抗氧化活性，故没有预防噪声性聋的作用。
Xd6hp/Dk] F0中国论文网a@ I1zQ R(D 本实验证实长时间的强烈噪声暴露能引起听阈提高和耳蜗中ROS含量增高，咪唑安定对噪声性聋有一定的预防作用，噪声性听力损失可能与ROS密切相关。这为耳科手术中使用电钻造成噪声性聋的预防提供了科学依据。目前研究还限于动物实验阶段，咪唑安定在临床应用上的剂量还有待于进一步探讨。
中国论文网[ T@y s7A f~中国论文网 w$O!T3E7`2OQM9]【参考文献】
A cP&{hH0 1]OHINATA Y, MILLER JM, ALTSCHULER RA, et al. Intense noise induces formation of vasoactive lipid peroxidation products in the cochlea [J]. Brain Res, 2000, 878(1-2):163-173.
F/v,W!JO.o.`w(_0中国论文网/c2o^ ^-?2t~r [2]YAMASOBA T, POURBAKHT A, SAKAMOTO T, et al. Ebselen prevents noise-induced excitotoxicity and temporary threshold shift [J]. Neurosci Lett, 2005, 380(3):234-238.
%dS?T
f G{3^0
]0dZ&@ h5H,W#Y9a0 [3]CHUNG JW, AHN JH, KIM JY, et al. The effect of isoflurane, halothane and pentobarbital on noise-induced hearing loss in mice [J]. Anesth Analg, 2007, 104(6):1404-1408.
中国论文网:O+UL E3_vG3c中国论文网 I:] Bx |
IP6A [4]MILLER JM, BROWN JN, SCHACHT J. 8-iso-prostaglandin F(2alpha), a product of noise exposure, reduces inner ear blood flow [J]. Audiol Neurootol, 2003, 8(4):207-221.
中国论文网;I9h.F
U DJz \1X3b+^0]fWwBIm0 [5]McFADDEN SL, WOO JM, MICHALAK N, et al. Dietary vitamin C supplementation reduces noise-induced hearing loss in guinea pigs [J]. Hear Res, 2005, 202(1-2):200-208.
中国论文网 q
c/y3L_ |.Q/Y中国论文网"e%f7yGhJ,i9P [6]HOU F, WANG S, ZHAI S, et al. Effects of alpha-tocopherol on noise-induced hearing loss in guinea pigs [J]. Hear Res, 2003, 179(1-2):1-8.
中国论文网;s G%hZ D i1u$Q)W7E,iA9~0 [7]MURPHY PG, MYERS DS, DAVIES MJ, et al. The antioxidant potential of propofol (2,6-diisopropylphenol) [J]. Br J Anaesth, 1992, 68(6):613-618.
中国论文网8c4}%ei
Z [F8y,sJJy+}o]0 [8]吴新文，董庆龙，钟少平，等. 异丙酚和咪唑安定对氧自由基的影响 [J]. 中华麻醉学杂志, 1998, 18(1):25.
中国论文网 M's p$m.hGw1[/H.y _L
b0 [9]NISHINA K, AKAMATSU H, MIKAWA K, et al. The inhibitory effects of thiopental, midazolam and ketamine on human neutrophil function [J]. Anesth Analg, 1998, 86(1):159-165.
发给朋友
分享到朋友圈
回顶部