安喘颗粒提取工艺研究

【摘要】  目的 优选安喘颗粒的提取工艺。方法 以盐酸麻黄碱为评价指标,选用正交表进行试验,考察麻黄等6味药的水提工艺中的用水量、提取时间及提取次数对盐酸麻黄碱含量的影响；以苦参碱、氧化苦参碱含量为评价指标,考察苦参等2味药的醇提工艺中的乙醇浓度、乙醇用量、提取时间及提取次数对苦参碱和氧化苦参碱含量的影响。结果 确定最佳方案为：麻黄等6味药材加水煎煮2次,每次2 h,第1次加854 mL,第2次加732 mL；苦参等2味药材加80%乙醇回流提取2次,每次2 h,第1次加288 mL,第2次加240 mL。结论 优选得到的提取工艺合理、操作可行、质量可控。中国论文网#C}!Hq
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【关键词】  安喘颗粒；正交试验；盐酸麻黄碱；苦参碱；氧化苦参碱；高效液相色谱法
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p~GRg0]t$C+_*_0    Key words：Anchuan Keli；orthogonal test；ephedrina hydrochloridum；matrine；ammothamnine；HPLC
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cm*u\}"PW\0    安喘颗粒原处方来源于江苏省中西医结合医院呼吸科朱启勇主任的临床验方,由麻黄、乌梅、甘草、苦参等8味药组成。安喘颗粒治疗支气管哮喘具有显著疗效。为克服原方汤剂用量较大且使用较为繁琐等不足,对本方进行开发。本研究采用正交试验法对提取工艺进行优选。中国论文网Vl&l!qb
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　　l  仪器与材料
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I'vL }vB8v6N Z1m/mp0    AL204万分之一电子天平(梅特勒公司产品)；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司产品),DAD检测器,Agilent Chemstation色谱数据工作站。盐酸麻黄碱(批号171241-200303)对照品、苦参碱(批号0805-970)对照品、氧化苦参碱(批号780-9001)对照品均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、磷酸为色谱纯；甲醇为分析纯。麻黄Ephedra sinica Stapf、苦参Sophora flavescens Ait等均购自南京市药材公司。中国论文网8}C9LG#D8~:d
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　　2  方法与结果中国论文网&}5^ LQ0f;}!meY"w9k

EO/D I0T fm7s4?0　　2.1  苦参等2味药材提取工艺
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x&h0　　2.1.1  正交试验设计
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+f'J^WGv0　　选择醇浓度、溶媒量、提取时间和提取次数,按L9(34)正交试验。因素水平见表1。表1  醇回流工艺因素水平表（略）
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　　2.1.2  苦参碱、氧化苦参碱含量测定 中国论文网,DgTZcgh%^
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　　色谱条件：ZORBAX SB- C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)色谱柱；流动相：乙腈-3%磷酸溶液(6∶94)；检测波长：205 nm；流速：0.6 mL/min,柱温：室温。学术论文发表
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    对照品溶液的制备：精密称取苦参碱、氧化苦参碱各适量,置于同一10 mL容量瓶中,用流动相稀释并定溶至刻度,摇匀；再从中精密吸取1 mL,置于5 mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,即得(1 mL含苦参碱0.001 5 mg、氧化苦参碱0.019 6 mg)。
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/}w'FTW%t1r{0　　供试品溶液的制备：按照处方称取苦参等2味药各一定量,按正交试验表(见表2)各行所列条件制备样品。精密吸取上述样品溶液适量(约相当于苦参原药材0.08 g),通过中性氧化铝柱(100～200目,5 g,内径1 cm),依次用氯仿、氯仿-甲醇(7∶3)各20 mL洗脱,合并洗脱液,回收溶剂至干,残留物用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,摇匀；从中精密吸取1 mL置5 mL容量瓶中,用乙腈-3%磷酸溶液(6∶94)稀释并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。表2  醇回流提取工艺正交试验结果（略）中国论文网6UH^^&q
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　　分别吸取对照品、样品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,测定苦参碱、氧化苦参碱的含量。结果见表2,方差分析见表3～表6。表3  苦参碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0 表4  氧化苦参碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0表5  综合评分方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0
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　　直观分析结果表明,影响苦参碱的主要因素为D,其次为C,A和B因素的影响最小,最佳水平组合为A1B3C3D3；影响氧化苦参碱的主要因素为D,其次为B,A和C因素的影响最小,最佳水平组合为A3B3C3D3。因二者最佳组合不完全一致,且二者同等重要,因此,以各自最高数据计为10分,其余以此折算,并合计为综合评分(综合评分＝苦参碱含量/最高苦参碱含量×10×50%＋氧化苦参碱含量/最高氧化苦参碱含量×10×50%),结果表明(见表6),影响的主要因素为D,其次为B和C,A因素的影响最小,最佳水平组合为A3B3C3D3。
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    进一步以苦参碱为指标进行方差分析(见表3),D因素有显著性影响；综合考虑,A因素影响均较小,所以A因素选择A3；B因素影响也较小,且B因素的二、三水平差异较小,所以B因素选择B3；C因素的最佳水平均为C3,因此C因素选择C3。以苦参碱为指标,D因素具有显著性,进一步对D因素进行水平间多重比较(见表6),结果表明D3和D1之间有显著性差异,而D3与D2、D2和D1之间均无显著性差异。虽然最佳为D3,结合生产实际和节省能源,拟选择D2。因此,安排验证试验A3B3C3D3和A3B3C3D2。表6  苦参碱含量D因素多重比较（略）中国论文网_ e xxui-]
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　　2.1.3  验证试验 学术论文发表 中国论文网c9z%R:p4f~(d&z

kn4N&ICw$Go"d0　　分别采用理论最佳工艺A2B3C3D3和拟采用的工艺A3B3C3D2制备样品。苦参碱、氧化苦参碱含量测定同“2.1.2”项下方法操作。结果理论最佳工艺的苦参碱含量为0.661 8 mg/g苦参原药材,氧化苦参碱含量为21.039 4 mg/g苦参原药材；拟采用工艺的苦参碱含量为0.521 1 mg/g苦参原药材,氧化苦参碱含量为20.020 7 mg/g苦参原药材。试验结果表明,提取3次与提取2次相比,多提取一次苦参生物碱总含量仅增加了5.34%,但是乙醇和能耗增加较大,因此,确定提取次数为2次。
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　　2.1.4  结论
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Rz%[:o0　　根据正交试验和验证试验结果,确定苦参等2味药的提取工艺为药材加80%乙醇回流提取2次,每次2 h,第1次加288 mL(考虑到干药材会吸约2倍量的水,根据实际第1次多加),第2次加240 mL。
-piFA,_Bj02.2  麻黄等6味药材提取工艺中国论文网c+g*^!_,q6K5Z/A2e

Fj g+M%PK%]@0    预试验比较了麻黄单独水提取、70%乙醇提取,麻黄、乌梅、甘草等合并水提取,麻黄、乌梅、甘草等合并70%乙醇提取。结果表明,麻黄与乌梅、甘草等合并水提取和醇提取盐酸麻黄碱含量都分别略高于麻黄单独水提取和醇提取,因此,可以推测合煎时有机酸的存在更有利于盐酸麻黄碱的溶出,但合并醇提取盐酸麻黄碱含量比合并水煎煮仅提高7.45%,综合考虑采用麻黄、乌梅、甘草等合并水提取。
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2t)["B.v;P$Z/_J)a0　　2.2.1  正交试验设计 中国论文网c"ju^cu({;]IXj

V/c+`:ka$p7tTJp0　　选择加溶媒量、提取时间和提取次数,按L9(34)进行正交试验。因素水平见表7。表7  水提取工艺因素水平表（略）中国论文网 Q\9ke"e:@J[2r

j@ik.t(iU)s/R2g0　　2.2.2  盐酸麻黄碱含量的测定
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　　色谱条件：ZORBAX SB-C18 (5 μm,4.6 mm×150 mm)色谱柱；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(10∶90)；检测波长：207 nm；流速：0.6 mL/min,柱温：室温。中国论文网$f6zUd M_\fe*G
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　　对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱1.68 mg,置于10 mL容量瓶中,用流动相溶解至刻度,摇匀；从中精密吸取1 mL,置于10 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得(1 mL含盐酸麻黄碱0.016 8 mg)。
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OcF4i;Iv9m|0    供试品溶液的制备：按照处方称取麻黄、乌梅、甘草等药材各一定量,按正交试验表(见表8)各行所列条件制备样品溶液。精密吸取上述样品溶液适量(约相当于麻黄生药量0.008 g),置中性氧化铝柱(100～200目,1.5 g,内径1 cm)上,用50%甲醇溶液洗脱至10 mL量瓶中约至9 mL,加1滴磷酸,用50%的甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得供试品溶液。中国论文网w'[,P#\*g%Z
  
4`@]'RHx?0　　分别吸取对照品、样品溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪,测定盐酸麻黄碱的含量。结果见表8。方差分析见表9。 表8  水提取工艺正交试验结果（略）表9  盐酸麻黄碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0中国论文网:x
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1x]#Ke9C9V5c0    直观分析结果表明,影响盐酸麻黄碱的主要因素为C,其次为A因素,B因素的影响最小,最佳水平组合为A3B3C3。进一步以盐酸麻黄碱进行方差分析,因素A、B、C均有极显著性影响。因此,A因素拟选择A3；同样,B因素拟选择B3；虽然最佳为C3,但从生产实际和节省能源角度考虑,可以选择C2。因此,安排验证试验A3B3C3和A3B3C2。
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　　分别采用理论最佳工艺A3B3C3和拟采用的工艺A3B3C2制备样品。盐酸麻黄碱含量的测定采用“2.2.2”项下方法操作。结果理论最佳工艺的盐酸麻黄碱含量为25.13 mg/g麻黄药材；拟采用工艺的盐酸麻黄碱含量为24.75 mg/g麻黄药材。试验结果表明,提取3次与提取2次相比,多提取一次盐酸麻黄碱含量仅增加了1.54%,但能源消耗大大增加,因此,从生产实际出发确定提取次数为2次。中国论文网J^&wHSH(_,x9ZH

jB4f&uDY+i&f3z0　　2.2.4  结论 中国论文网9S't"@RV;F[

!_Ou v"o(FT(p*I:A0　　根据预试验、正交试验和验证试验结果,确定麻黄等6味药材的提取工艺为药材加水煎煮2次,每次2 h,第1次加854 mL(考虑到干药材会吸约2倍量的水,根据实际第1次多加),第2次加732 mL。
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　　3  讨论中国论文网 @L/|1Lhm'DF
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    盐酸麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱的药理作用在很大程度上与该复方的传统功能主治及临床应用具有一致性。因此,选择盐酸麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱以及总提取物含量作为提取方法的考察指标较为合理。
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    对苦参等2味药的醇提液进行苦参碱、氧化苦参碱含量测定时,按药典方法[2]测定,空白液有干扰。对药典的色谱条件进行改进,采用ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)色谱柱,流动相为乙腈-3%磷酸溶液(6∶94),检测波长为205 nm,可消除干扰。中国论文网b,K)`j bc]1Hk
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【参考文献】
x#M?8vss V4yon2j0  [1] 赵陆华.高效液相色谱法分析中药成分手册[M].北京：中国医药科技出版社,1994.398.
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9{;l'm&PTV(|0　　[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.141.学术论文发表

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