【摘要】 目的： 以复制缺陷型重组腺病毒为载体，使用人野生型p53基因、人GM?CSF基因和B7?1基因为目的基因，探讨三基因在胰腺癌细胞BxPC?3中的表达。方法： 免疫组织化学方法检测外源性p53蛋白在BxPC?3细胞中表达。ELISA方法测定GM?CSF表达量；流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测BxPC?3细胞转染B7?1的表达效果。结果： 重组腺病毒介导的p53基因、GM?CSF基因、B7?1基因在BxPC?3细胞中得到高效表达。结论： 重组腺病毒介导的外源基因在BxPC?3细胞中得到高效的表达，为进一步探讨其体内外治疗胰腺癌的实验研究提供了理论基础。
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@:M-c教育教学论文发表 N/_B0Vv!GO0【关键词】 胰腺癌； 基因治疗；腺病毒； 抑癌基因p53； 粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子； 免疫共刺激分子B7?1
DX(Z8R d0(n(G ]4ty/h0 ［Abstract］Objective: To study the expression of human wild?type p53,GM?CSF and B7?1 genes mediatedly adenovirus vetor on human pancreatic carcinoma cell line BxPC?3.Methods： The expression of p53 protein was examined by immunohistochemical analysis. The expression of GM?CSF was detected by sandwich ELISA analyses with culture supernatant. The expression of B7?1 was detected with FCM. Results： BxPC?3 cells were transfected with DMEM, Ad?GFP,AD?WTp53?GMCSF?B7?1.The cells transfected with the Ad?WTp53?GMCSF?B7?1 resulted in positive expressing the wild?type p53 protein,GM?CSF and B7?1,but not in DMEM and Ad?GFP transfected cells. Conclusion： The expression on human pancreatic carcinoma with adenovirus?mediated human wild?type p53,GM?CSF and B7?1 genes was more effective.These results provided a basis for further ex vivo and in vivo studies of combined gene therapy for pancreatic carcinoma.
L+h8hH9q7~#{0中国论文网j.n ]a/cM'a#bI ［Key words］pancreatic carcinoma; gene therapy; tumor suppressor p53; granulocyte?macrophage colony?stimulating; costimulatory B7?1; adenovirus
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Ej5K@5QB{W0 胰腺癌是消化道的恶性肿瘤之一，其早期诊断率和手术切除率均较低。随着分子生物学技术的进步以及对胰腺癌病因学研究的深入，出现了胰腺癌新的治疗方法基因治疗。本文就重组腺病毒介导的人野生型p53,GM?CSF和B7?1基因在胰腺癌细胞中的表达作一研究，为下一步进行体内外治疗胰腺癌的实验研究提供理论基础。
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o3{'l({F,a(Y0 1 材料与方法
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J E 1.1 材 料
W4F~!{7o^0 zv ucm0 病毒株Ad?GFP、 AD?WTp53?GMCSF?B7?1(解放军302医院生物工程室王福生教授惠赠）。人胰腺癌细胞系BxPC?3为本室保存，培养条件为DMEM，10%胎牛血清，37℃，5.0%CO2。 主要试剂：①免疫组织化学检测试剂盒；②鼠抗人p53单克隆抗体；③DAB显色试剂盒；④FTTC标记的鼠抗人单克隆抗体B7?1；⑤GM?CSF ELISA试剂盒。
9J aES/`bB0-r [&sG C A0V v*L6l0 1.2 方法
教育教学论文发表 中国论文网5b;R8vaK-|CqQI;oE1p6N&W%I V0 1.2.1 免疫组织化学法检测人野生型p53基因在人胰腺癌细胞BxPC?3中的表达
*uF'f |:p0中国论文网2|&M$s5@n NCmcS BxPC?3细胞以1×105细胞/孔接种于6孔培养板，每孔底部加一块盖玻片，使细胞能够自然生长于玻片上。12 h后分别以Ad?GFP、AD?WTp53?GMCSF?B7?1（稀释于0.4 ml DMEM）感染各孔中的细胞，MOI为50 pfu/细胞，以DMEM为对照。1～2 h后吸去病毒液，每孔加入2 ml培养液。48 h后将玻片取出，进行如下处理：3.8%甲醛溶液固定10 min；PBS洗3次，每次5 min；每张片加100 μl过氧化酶阻断液（3.0%H2O2?甲醇溶液），室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS洗3次，每次5 min；每张片加100μl的非免疫性动物血清，即10%的小牛血清白蛋白（BSA）（溶于PBS），室温孵育5 min，PBS洗1次；每张片滴加100 μl经200倍稀释的鼠抗人p53单克隆抗体PAB1801（第一抗体），4℃过夜；PBS洗3次，每次5 min；每张片滴加100μl的生物素标记的二抗IgG/Bio，室温下孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；每张片加100μl链亲和素?过氧化物酶液，室温下孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；每张片滴加100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5～10 min，以水冲洗，树脂封片，室温风干后保存。阳性对照为已知阳性片。p53 阳性染色主要位于细胞核，呈棕黄色颗粒状。
;k!\&QP3A? h|l0F O-Fo{rr f)X0 1.2.2 ELISA检测腺病毒介导的GM?CSF基因在BxPC?3细胞中的表达
中国论文网0Z:@FC$fg(o&@中国论文网6IQ/?.~ WNyY7`*n;X'a 1.2.2.1 ELISA样品制备
${H6}tOev l6u0Mw3n5V9J%T eM0 BxPC?3细胞以1×105细胞/皿的量接种于60 mm平皿中，12 h后以AD?WTp53?GMCSF?B7?1感染各皿中的细胞，MOI为50 pfu/细胞，以DMEM 为对照。1～2 h后吸去病毒液，加入新鲜培养液。以后每24 h收集培养上清液，并且更换新鲜培养液，连续10 d。每次将收集的培养上清液立即分装，200 μl/管，-80℃冻存。
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b0 1.2.2.2 ELISA检测培养上清液中GM?CSF的含量
中国论文网M2l:NuS;I中国论文网T;Al q M 将100 μl不同浓度的GM?CSF标准品（1 000，500，250，125，62.5，31.25，0 pg/ml）分别加入酶连板（用鼠抗人GM?CSF单克隆抗体包被过）的各孔中；将不同时间点收集的培养上清液分别稀释10倍，加到酶连板的各孔中，100 μl/孔；加50 μl生物素化的抗?CD116于各孔中（1∶20稀释），用胶纸盖好后，在室温下避光孵育3 h；吸出每孔中的液体，以无菌水将200×洗涤浓缩液稀释200倍，配成洗涤液，以300 μl洗涤液将各孔洗3次；用缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的GM?CSF抗体，每孔加入100 μl稀释后的GM?CSF抗体，用胶纸盖好，室温孵育30 min；用洗涤液将各孔细胞分别洗3次；每孔中加入100 μl底物工作液TMB，室温下避光孵育20～25 min；每孔中加入100 μl终止液H2SO4，30 min内以酶联仪测定各孔在450 nm的吸收值，并根据标准曲线计算各样品中GM?CSF的含量。
8u+o Um3f`!q @0教育教学论文发表 &kB&th
j d0 1.2.3 流式细胞术检测B7?1基因的表达
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v0 中国论文网0YH9@N%Y/G
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j BxPC?3细胞以1×105细胞/皿的量接种于60 mm平皿中，12 h后以AD?WTp53?GMCSF?B7?1感染各孔中的细胞，MOI为50 pfu/细胞，以DMEM为对照（空白对照及阴性对照），1～2 h后吸去病毒液，加入新鲜培养液；48 h后用0.02%EDTA消化离心细胞，依次用PBS及PBA（PBS加2%BSA，加0.1%叠氮钠）各洗1次，实验组及阴性对照组各加入15 μl FITC标记的B7?1单抗，4℃温育30 min，再依次用PBA和PBS各洗1次，1%低聚甲醛固定；空白对照组细胞依次用PBA和PBS各洗1次后，不加B7?1单抗，直接用1%低聚甲醛固定；FCM测定表达。
[ p zM:V^Pe,^`U0 中国论文网/M K.y6{ N n 2 结 果
中国论文网B:? Gs#Fm;b VQ+bn)[i[4_0 2.1 重组腺病毒介导的人野生型p53基因在胰腺癌细胞中的表达
,nv+w ~jEo6Y0中国论文网2n jh+d].YqER;{6N 免疫组化技术检测p53蛋白在BxPC?3中表达以及转染Ad?GFP、 AD?WTp53?GMCSF?B7?1后的表达情况,结果显示BxPC?3细胞中未见到有p53蛋白表达,转染Ad?GFP后也未见表达;而在 AD?WTp53?GMCSF?B7?1组可见有p53蛋白表达（图1）。
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W 2.2 重组腺病毒介导的人GM?CSF基因在胰腺癌细胞中的表达
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N(p M#dPX 如图2所示，感染2～5天是GM?CSF表达高峰期，随后表达量逐渐下降。
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q0 2.3 重组腺病毒介导的人B7?1基因在胰腺癌细胞中的表达
2[b(ac(L/L,m0中国论文网s)v;ZAuvO GM 如图3所示，正常BxPC?3细胞表面B7?1分子表达很弱，为7.99%。当以AD?WTp53?GMCSF?B7?1感染细胞（MOI为50 pfu/细胞）时，48 h后其表达为93.26%。因此，AD?WTp53?GMCSF?B7?1介导的外源性B7?1基因可在BxPC?3细胞高效表达。
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B]$D5i]:| 胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%～2%。由于胰腺癌早期缺乏特异症状，因此早期诊断很困难，而且手术切除率仅为10%～15%，5年生存率低于5%，预后很差［1,2］。基因治疗的出现为胰腺癌的综合治疗提供了一条新的途径。基因治疗的关键问题包括基因的导入系统、治疗基因的选择以及基因的高效表达。基因导入系统，要能将治疗基因输送到特定的靶细胞，从而能在该细胞中得到高效表达。腺病毒是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体，具有以下优点［3,4］：腺病毒颗粒比较稳定，病毒基因组较少发生重排，插入外源基因组在连续传代中一般保持不变，因此没有致癌和致突变的危险；宿主范围广，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；容易制备、纯化和浓缩而获得高滴度病毒因子。腺病毒基因组可以插入大片段的外源基因，外源基因表达水平较高。由于本研究用于转移的3个目的基因片段较长，选用腺病毒作为转移载体满足了载体容量大、安全性好及容易复制等要求。
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G;m:`,m0 教育教学论文发表 9Mq7w"x$I(\;X0 在治疗基因的选择上，本研究采用抑癌基因人野生型p53，细胞因子GM?CSF基因和共刺激分子B7?1基因。p53是多年来备受人们关注的一种抑癌基因［5］,在细胞中有很多功能,其中与肿瘤密切相关的有两方面:一方面是抑制癌细胞增殖,使细胞停滞在细胞周期的G1期;另一方面诱导癌细胞凋亡。人类一半以上的肿瘤中可检测到p53基因的突变或缺失；将人野生型 p53基因导入p53 异常的肿瘤细胞时，大量表达的外源性p53蛋白可发挥强大的抑瘤功能［6-8］。即使对于那些存在野生型p53基因的肿瘤细胞，高表达的外源性p53蛋白也表现出明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用。大量的体外实验已经证实了p53基因可以抑制恶性黑色素瘤、子宫颈癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌以及前列腺癌癌细胞生长，诱导细胞凋亡。本实验采用免疫组化法发现外源性p53蛋白在胰腺癌细胞BxPC?3 中没有表达，说明在BxPC?3中有p53基因的缺失；而BxPC?3转染了AD?WTp53?GMCSF?B7?1后可见有p53蛋白的表达，说明外源的野生型p53基因得到了表达，表达后一方面可以控制细胞生长周期的调节，抑制细胞的增殖，还可以诱导细胞产生凋亡。
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SJO2edJ0 中国论文网5iV}3z%u|1Y+P2i GM?CSF的抗肿瘤作用和免疫作用表现在它可促进树突状细胞等抗原提呈细胞的分泌发育，增强其提呈能力；参与T细胞的活化，促进抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的诱导及对靶细胞的杀伤［9,10］。本实验中BxPC?3在转染了AD?WTp53?GMCSF?B7?1 后，GM?CSF表达可持续10天左右，高峰值位于2～5天，转染AD?WTp53?GMCSF?B7?1后第4天达最高值371.14 pg/ml。随后GM?CSF表达下降可能与以下因素有关：腺病毒在细胞中逐步被降解；细胞感染Ad?GFP或AD?WTp53?GMCSF?B7?1后逐步发生凋亡。我们认为将GM?CSF基因转染肿瘤细胞后，可在肿瘤局部维持较高浓度并可持续较长时间。肿瘤细胞局部持续存在的GM?CSF一方面可使肿瘤细胞表达MHC等抗原分子增加，使之免疫原性增强，为激活免疫功能打下基础；另一方面能吸引多种免疫细胞包括T细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞等的大量浸润并激活其功能，通过这些免疫细胞相互作用完成抗原提呈过程并通过直接或间接机制杀伤肿瘤细胞；还可以在局部诱导其他细胞因子产生，使相关细胞MHC 分子和黏附分子的表达增加，促进细胞间的相互作用，从而促进免疫功能进一步增强，最终有效地增强机体抗肿瘤的免疫功能。
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F#k0 B7 是共刺激分子之一,属于Ig超家族,为4 454 ku的糖蛋白，人B7基因定位于3号染色体q21,有6个外显子;它是B淋巴细胞激活抗原,表达于活化的B细胞上,而静止的B淋巴细胞上不表达。B7还表达于树突状细胞、IFN?γ激活的巨噬细胞。本研究发现和其他肿瘤类似，胰腺癌细胞BxPC?3表面的B7?1 分子表达很低，表面的B7?1仅为7.99%。肿瘤细胞之所以能够逃逸机体的免疫系统，是因为肿瘤细胞缺少一个启动杀伤性T细胞所必需的共刺激信号，而典型的共刺激途径是T细胞的CD28分子与肿瘤细胞的B7配基结合。为此，本研究利用AD?WTp53?GMCSF?B7?1对人胰腺癌BxPC?3细胞进行转染，发现B7?1表达达93.26%。这种高表达B7?1的肿瘤细胞可诱导产生全身性的抗肿瘤免疫反应，包括增强CD8+CTL对肿瘤的特异性杀伤作用和CD4+T细胞的辅助作用，它还可通过增强NK细胞的活性而杀伤肿瘤细胞［11,12］。
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IX$b0 &S'P+o Ut,^$i0 本研究证实了复制缺陷型腺病毒携带p53，GM?CSF和B7?1 3个目的基因可以在胰腺癌细胞BxPC?3中得到高效表达，为进一步开展其体内外治疗肿瘤的实验研究提供了理论基础。
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