【摘要】 目的： 研究积雪草酸（asiatic acid，AA）对人肝癌细胞株（HepG2）的抑制作用，并探讨其与线粒体之间的关系。方法： 采用MTT法检测AA对HepG2细胞增殖的影响，倒置显微镜观察细胞形态的变化；荧光探针MitoTracker检测线粒体数目；荧光探针JC?1检测线粒体膜电位；荧光探针DCFH?DA检测胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量；ATP试剂盒检测胞内ATP水平;RT?PCR和Western Blot法分析电压依赖性阴离子通道（voltage?dependent anion channel，VDAC）表达量的变化。结果： AA能够剂量依赖性抑制肿瘤细胞株的增殖，30 μmol/L AA作用细胞24 h后细胞突起消失、胞体皱缩、变圆。AA能够使HepG2细胞线粒体膜电位下降，胞内ROS含量增加，降低胞内ATP水平，50 μmol/L AA能够增加VDAC蛋白的表达量。结论： AA抑制肿瘤细胞增殖的作用与线粒体有关，线粒体VDAC参与人肝癌细胞凋亡的调控过程。
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N'h1t$m【关键词】 积雪草酸; 线粒体; 电压依赖性阴离子通道; 肝癌细胞株
中国论文网+ET(LOs+o7i1\*g/m H'kG e:yT(g z$k1J0 ［Abstract］Objective: To investigate the proliferation inhibition of asiatic acid(AA) on the human hepatoma cell line(HepG2) cells, and to study its potential correlation with mitochondria.Methods： The effect of AA on proliferation of HepG2 was tested by MTT, morphology of tumor cells was observed under inverted microscope; the mitochondrial mass was described by the fluorescence intensity of MitoTracker probe, mitochondrial membrane potential was detected with fluorescent probe JC?1, intracellular reactive oxygen species(ROS) content was detected with DCFH?DA，intracellular ATP level was measured by ATP Assay Kit, and the expression of voltage?dependent anion channel(VDAC) on mitochondrial outer membrane was determined by RT?PCR and Western Blot. Results： AA inhibited the proliferation of tumor cell lines(HepG2) dose?dependently, and cells rounded and shrank after treated with 30 μmol/L AA for 24 h.Mitochondrial membrane potential depolarized, intracellular ATP level decreased and ROS content increased dose?dependently after treating with AA, and VDAC expression was up?regulated by 50 μmol/L AA. Conclusion： AA exerted anti?tumor effects, which was related with mitochondria mediated death, and VDAC was involved in the cell death pathway.
E x.cdZ5O@P!^0中国论文网7B tNsp ［Key words］asiatic acid; mitochondria; voltage?dependent anion channel（VDAC）; HepG2 cells
中国论文网O] qQ.re3UP?t中国论文网i Fv G{? 肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高。抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，是抗肿瘤药物作用的共同机制。线粒体在细胞死亡调控中发挥重要的作用，已成为癌症化学疗法的靶点［1］，通过线粒体途径诱发肿瘤细胞凋亡，是目前抗肿瘤药研发的重要方向之一。
S0J)R;u%[6J {2o0C z+y Z3O`'i-W0 积雪草酸(asiatic acid, AA),又名亚细亚酸,是我国传统中药积雪草的五环三萜类组分之一。经研究证明, AA具有对抗CCl4和D?GalN诱导的肝损伤［2, 3］、减弱化疗药物抗肿瘤的不良反应［4］、对抗神经细胞的氧化损伤［5］等作用。另外,也发现AA具有抑制黑色素瘤细胞增殖［6］、诱导直肠癌细胞凋亡的作用［7］。本研究探讨了AA对肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用及其与线粒体之间的关系。
中国论文网zj5Sm3oc l中国论文网9D7f$X)sa ~N/La,S[ J 1 材料与方法
\w;^4|]3KwI0发表论文网 7G E*m7E F3u
y7b `0 1.1 材 料
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lkD]6|m"k.g#e e中国论文网 e3H7j$M'i f\ T 1.1.1 实验材料
#| d E @0U,x |3u0中国论文网;t w [DPb HepG2(人肝癌细胞株)由南京大学徐力致老师惠赠。 AA（Sigma 公司产品，美国）；MEM培养基（Gibco 公司产品，美国）；0.25%胰蛋白酶（Amresco 公司产品，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）；MitoTracker Red FM（Invitrigen公司，美国）；JC?1（Molecular Probes 公司，美国）；MTT（Amresco 公司产品，美国）；鼠抗人β?肌动蛋白单克隆抗体（Abcam公司，美国）；鼠抗人VDAC抗体（Abcam公司，美国）；羊抗小鼠 IgG?HRP(horseradish peroxidase)（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL 超级发光液（碧云天生物工程公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余未特殊注明的试剂均为进口或国产分析纯。
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O0G8O&E J0'Bw:q? \ aT Q0 1.1.2 主要仪器
中国论文网&Z1Y&z9i;Bv&@;~xx? ?9X0 Spectra Max 190酶标仪（Molecular device，美国）；Spectra MaxGemini荧光酶标仪（Molecular device，美国）；核酸蛋白分析仪（岛津公司，日本）；Bio?Rad电泳仪（Bio?Rad，美国）；TE2000荧光显微镜（尼康公司，日本）。
中国论文网t |2z-y+LbOODhz*VzEZ0 1.2 实验方法
中国论文网1Y.s'G rT中国论文网.Y Sv-X"l/y 1.2.1 细胞培养
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u7rq0中国论文网1NPZ+_p7bk HepG2细胞用含10%小牛血清的MEM培养基培养。将细胞接种于培养瓶中， 置于37 ℃、5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养，2～3 d传代1次。
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ncx0中国论文网.sc[gm7^2c o 1.2.2 MTT法测细胞存活率
jf!Z$R8LV3x0)G8m+{%v(E3l[0 4×104 ml-1细胞100 μl 接种于96孔细胞培养板中培养24 h，加不同浓度AA处理24 h，弃去培养基，每孔加100 μl MTT（D?hank′s液溶解，浓度为1 g/L），37 ℃继续孵育4 h后，吸去培养液，每孔加DMSO 100 μl，待结晶物充分溶解，1 h后用酶标仪于570 nm处测光密度。结果用抑制率表示，计算公式如下：
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RBho02hd?#`*S.l!a0 抑制率＝对照组平均D570-给药组平均D570对照组平均D570-空白组平均D570×100%
n@1_ P&m(G"L0中国论文网 R P.U A B%t7i 1.2.3 MitoTracker染色检测线粒体数目
中国论文网 e/qYC(GZAY发表论文网 中国论文网9yNa&p
N \ HepG2细胞经10，30，50 μmol/L AA处理24 h 后，用MitoTracker探针检测线粒体数目的变化，吸去培养孔中的培养基，加入37℃预温的含100 nmol/L MitoTracker的培养基100 μl，37℃孵育30 min。PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex588 nm/Em644 nm）。
中国论文网wIE#pf Y*o中国论文网4a+l3A'TU k4} 1.2.4 JC?1染色测线粒体膜电位
中国论文网2Z/t q;\ F5[X中国论文网
bT5`N4`.}]4Jx*y 4×103个HepG2细胞接种于 96 孔培养板中，以不同浓度AA作用于HepG2细胞24 h后，吸掉培养基,加入2.5 μg/ml的JC?1染料，37 ℃下避光孵育10 min，PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex488 nm/Em525，590 nm）。
中国论文网9h0U0I"|#pQU(B#O)t r5E"~P
K3N4P0 1.2.5 ATP检测试剂盒测定胞内ATP水平
O Z5\9tp}$X }b0 @+qC#D!n Y6YHG q\0 1.5×104个HepG2细胞接种于6 孔培养板中，以不同浓度AA作用24 h后，吸掉培养基，每孔加入200 μl裂解液裂解细胞。加100 μl ATP检测试剂到检测孔内，室温放置3～5 min后，再在检测孔内加上100 μl裂解细胞样品，迅速用枪混匀，间隔2 s后，立即用化学发光酶标仪测定荧光强度。
中国论文网qD)Ip.C,z gtb K P yc_ j0 1.2.6 DCFH?DA探针法检测胞内ROS含量
中国论文网 Q V@g5T#aw Ga,tS6P+B0 4×104 ml-1 HepG2细胞培养24 h，经不同浓度的AA处理24 h后，加入无血清培养基稀释的DCFH?DA溶液，使其终浓度为10 μmol/L，37 ℃下负载探针30 min，PBS洗２次。用荧光酶标仪检测荧光强度（Ex488 nm/Em525 nm），同时用荧光显微镜观察细胞的形态及荧光。
.h` o\$YL0m\UX,}0/d/Qc6w"O'`4iq%^0 1.2.7 肝癌细胞VDAC基因检测
中国论文网j(n0s8},l#?.m)y|,Q Gj%g W!U"p0 1.2.7.1 mRNA水平
,F}#zRQ7eV Q_0中国论文网,oT/~
]lF`q4z ? 反转录采用Invitrogen公司试剂盒说明书所述步骤；聚合酶链式反应(PCR)扩增反应体系：2.5 μl 10×缓冲液，1 μl dNTP，2 μl MgCl2，0.5 μl Taq DNA聚合酶，1 μl cDNA模板，1 μl 引物(VDAC)?A，1 μl 引物(VDAC)?S，1 μl 引物(β?肌动蛋白)?A，1 μl 引物(β?肌动蛋白)?S，13 μl 无菌水；引物序列为引物(VDAC)?S：5′?AGTGTGACGTTGACATCCGTA?3′，引物(VDAC)?A：5′ ?GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT?3′；引物(β?肌动蛋白?S: 5′?GGCTACGGCTTTGGCTTAAT?3′，引物(β?肌动蛋白)?A: 5′?CCCTCTTGTACCCTGTCTTGA?3′。反应先经过95 ℃ 2 min，然后是28个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后于72 ℃延伸反应4 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
SN*J&C$I k0发表论文网 中国论文网4C7X0d8S _E
NyCv y 1.2.7.2 蛋白水平
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n.?x_1pshu4Oo0 采用蛋白质印迹法检测。提取各组细胞总蛋白，进行蛋白定量后，样品按比例加入3× SDS凝胶上样缓冲液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白进行上样，电泳。50 V恒压4 h将蛋白转至PVDF膜；封闭液(1 g脱脂奶粉，0.2 g BSA溶于20 ml PBST溶液)封闭1 h；一抗孵育（抗VDAC抗体1∶2000；抗β?肌动蛋白抗体1∶5000）4 ℃过夜；PBST清洗5次，每次10 min；二抗孵育（1∶3000），室温1 h；PBST清洗5次，每次10 min；ECL发光液发光，暗室内X光片感光、显影、定影、观察。
Mis1SxOk0中国论文网W8?f:E J 1.2.8 统计方法
z:h#T1M&f'L0中国论文网YHJ0I)f%S k;R 数据资料以±s表示，用SAS软件进行单因素方差分析（one way analysis of variance, ANOVA），组间比较进行q检查，显著性标准为α=0.05，所有实验重复3次。
中国论文网f7@|+E(c6e!f(^D%QX&oO/J
d6p t0 2 结 果
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e 2.1 AA抑制肿瘤细胞增殖
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x%[&F2|!} W0Ij YU \%|;z8|1{"Q0 如图1所示，HepG2细胞经终浓度分别为20，30，40 μmol/L的AA溶液处理后，细胞生长受到抑制，细胞形态改变，如突起消失，胞体皱缩变圆等。
%f+q U Xfu6a P0 p e QXa8np,g0 由图2 MTT结果发现, 与对照组比较，低浓度AA（20 μmol/L）组对HepG2细胞的生长没有明显影响；当剂量达到40 μmol/L 时，AA对HepG2细胞增殖有显著抑制作用，抑制率达78%，由此AA在HepG2细胞株上的IC50值为27 μmol/L。
m.U f,lq*]+c0 中国论文网.`-MLA,}0qAg;{ 2.2 AA对HepG2 细胞线粒体数量的影响
d bQ Z/bYe0 结果如图3所示，与对照组比较，10 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了11%，30 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了146%，50 μmol/L AA 组细胞荧光强度减少了44%，即线粒体数量随着AA浓度的升高，有一个先升高后降低的过程。
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}aC 2.3 AA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响
E"qTX)@3kD3Y*z0 o"O O/?$@d7ac0 HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后，加JC?1荧光探针检测线粒体膜电位的变化，结果见图4。从图4b荧光照片可见：对照组线粒体全为红色，说明膜电位较高；经20 μmol/L 解耦联剂CCCP处理2 h只见绿色荧光，膜电位降低；经40 μmol/L AA处理24 h后的HepG2细胞线粒体呈草绿色或橙黄色荧光，说明线粒体膜电位发生不同程度地垮陷，线粒体功能受到影响。从图4a红/绿荧光强度比值分析直方图可知 30，40 μmol/L AA极显著地降低了HepG2细胞线粒体的膜电位。
S fs qn J"[Yq0 中国论文网)q'C,Qf s5Be 2.4 AA对HepG2细胞线粒体功能的影响
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Yw W6t7C(^7X2bm0 由图5可知，与对照组比，HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后胞内ATP水平呈剂量依赖性地降低。胞内ROS含量呈剂量依赖性升高。
中国论文网:x9_2U/bO.J 2.5 AA对HepG2细胞线粒体VDAC蛋白表达的影响
中国论文网r9i'}1G5R,D 中国论文网9c[ P%`a _ Wz 由图6a可看出，与对照组相比， 10，30，50 μmol/L AA对VDAC转录水平基本无影响，仅30 μmol/L AA处理组VDAC mRNA转录水平略有降低。由图6b可知以对照组VDAC与内参β?肌动蛋白免疫条带灰度扫描的比值为100%，则10，30，50 μmol/L AA组分别为97%，187%，397%，说明AA 剂量依赖性地上调了VDAC蛋白的水平。
中国论文网.UB.MB/L!V1m$Y YP 发表论文网 h X(H@ w0 3 讨 论
中国论文网Ez1Q HY8w中国论文网 BW F l jZ*d 我们在HepG2肿瘤细胞株上研究了AA的体外抗肿瘤作用，发现AA浓度依赖性抑制HepG2细胞株的增殖。这与之前的研究结果一致［4］。线粒体是调控细胞凋亡的关键因素，当线粒体受到药物毒性作用时，线粒体功能出现缺陷，线粒体数目增多可能是为了补偿这种缺陷而产生的反馈机制［8, 9］。因此30 μmol/L AA作用下线粒体数目增加，但膜电位明显降低，说明线粒体功能异常；当药物浓度继续增高时，线粒体损伤加重，反馈机制受到影响，线粒体的分裂不能正常进行［10］。50 μmol/L AA严重损伤线粒体，使之不能分裂，各种功能受损，线粒体数量大大减少。
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Upu AA通过诱导线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeably transition pore，mPTP）开放，导致线粒体膜电位垮陷，ATP水平下降，胞内ROS产量增多或清除率降低，最终诱导HepG2细胞死亡，可见AA可以通过线粒体介导通路诱导细胞死亡。
中国论文网a VgW2n(} b"KE/ll3rVDf\0 线粒体通透性转换孔mPTP由VDAC、腺嘌呤核苷酸易位子（adenine nucleotide translocator，ANT）、亲环蛋白D（cyclophilin D，Cyp D）等组成，是线粒体凋亡蛋白释放的主要通道。VDAC主要以两种方式调控线粒体介导的细胞死亡：一方面作为外膜上主要的蛋白孔道参与调控外膜的通透性，另一方面是与凋亡蛋白Bcl?2家族蛋白相互作用调控细胞凋亡。Yagoda等［11］指出VDAC可成为药物筛选的靶点。本实验室的研究表明，AA的保肝作用与逆转VDAC水平有关［2, 12］。实验结果表明，AA可以剂量依赖性诱导HepG2细胞线粒体VDAC蛋白表达量升高，AA的线粒体毒性很可能与VDAC有关。结合细胞内线粒体数目分析可以推断， 30 μmol/L AA作用时，HepG2细胞VDAC蛋白量的增加与线粒体数量增加有关；50 μmol/L AA作用时，HepG2细胞线粒体受到严重损伤，线粒体数目急剧减少，而VDAC蛋白孔道表达量显著增加，说明线粒体外膜VDAC蛋白形成的孔道增加。因此，AA的抗肿瘤作用与VDAC相关，但是其在线粒体上的靶点是否就是VDAC，值得进一步探讨。
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y0中国论文网 kr3h~.tw |eA h;b【参考文献】
中国论文网~!el:bkf/K} V+u ［1］Gogvadze V, Orrenius S, Zhivotovsky B.Mitochondria as targets for cancer chemotherapy［J］.Semin Cancer Biol, 2009, 19(1): 57-66.
中国论文网!M+}y+c5L D"N*x中国论文网1dr+Q b M J*M6E ［2］Gao J, Tang X, Dou H, et al.Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L.leaves and its two triterpenoids［J］.J Pharm Pharmacol 2004, 56(11): 1449-1455.
中国论文网+W Z!{;v @0H:[2@"F C `4keO0 ［3］杨光, 谭家驹, 何瑞华,等.积雪草酸阻断大鼠肝纤维化的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志, 2009, 15(7): 540-542.
*|.H5t?Rn0中国论文网 i y5MX*\k)o0l ［4］林娜, 高静, 方春钱,等.积雪草酸与化疗药物联用抗肿瘤效应的初步研究［J］.江苏大学学报：医学版, 2008, 18(6): 494-497.
#s'I)i1o
MS1U:x0Z0:b~ U|e q0 ［5］Lee MK, Kim SR, Sung SH, et al.Asiatic acid derivatives protect cultured cortical neurons from glutamate?induced excitotoxicity［J］.Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 2000, 108(1-2): 75-86.
#W R)`@*M9[#s0中国论文网,}1I'skD,b ［6］Park BC, Bosire KO, Lee ES, et al.Asiatic acid induces apoptosis in SK?MEL?2 human melanoma cells［J］.Cancer Lett, 2005, 218(1): 81-90.
,L z
t@m9n0o,K;qu c,z?;i0 ［7］Tang XL, Yang XY, Jung HJ, et al.Asiatic acid induces colon cancer cell growth inhibition and apoptosis through mitochondrial death cascade［J］.Biol Pharm Bull, 2009, 32(8): 1399-1405.
4U k5Z,n]-s_\j0发表论文网 中国论文网,@0dn T C ［8］Nugent SM, Mothersill CE, Seymour C, et al.Increased mitochondrial mass in cells with functionally compromised mitochondria after exposure to both direct gamma radiation and bystander factors［J］.Radiat Res, 2007, 168(1): 134-142.
nzR/ww;[O(kd03E`,u;h(lI&b0 ［9］Xia SL, Laterra J.Hepatocyte growth factor increases mitochondrial mass in glioblastoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345(4): 1358-1364.
中国论文网 W7p(Bp U/p#o5B中国论文网 u_#v9l(P @ ［10］Li F, Wang Y, Zeller KI, et al.Myc stimulates nuclearly encoded mitochondrial genes and mitochondrial biogenesis［J］.Mol Cell Biol, 2005, 25(14): 6225-6234.
Tv J5d E0O;[`&s0中国论文网r[3D.Z!|0D/Yv ［11］Yagoda N, von Rechenberg M, Zaganjor E, et al.RAS?RAF?MEK?dependent oxidative cell death involving voltage?dependent anion channels［J］.Nature, 2007, 447(7146): 864-868.
'D6f,u _#O'p6d+k0中国论文网UX h)to,l!Q:N/R9q ［12］Gao J, Chen J, Tang XH, et al.Mechanism underlying mitochondrial protection of asiatic acid against hepatotoxicity in mice［J］.J Pharm Pharmacol, 2006, 58(2): 227-233.
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