【摘要】 目的 检测脑缺血再灌注大鼠脑组织Livin、NF?κB和白介素（IL）?1β表达及观察阿托伐他汀对其表达的影响，探讨阿托伐他汀对脑缺血再灌注后的脑保护作用机制。方法 大脑中动脉线栓方法制作大鼠脑缺血再灌注模型；实验大鼠随机分为假手术组（S组）、模型组（M组）及阿托伐他汀治疗组（MT组）；免疫印迹法和RT?PCR检测大鼠脑组织Livin、NF?κB和IL?1β的表达，TTC染色法测量脑梗死体积。结果 梗死灶体积MT组较M组显著降低（P<0.05）， 较S组显著增高（P<0.01）；MT组NF?κB和IL?1β表达较M组降低(P<0.05），MT组Livin表达较M组增高 (P<0.05）；MT组Livin、NF?κB和IL?1β表达较S组增高(P<0.05）；M组Livin、NF?κB和IL?1β表达较S组显著增高(P<0.01）。结论 阿托伐他汀可以通过降低脑缺血再灌注大鼠脑组织NF?κB和IL?1β、增强Livin表达抑制细胞凋亡和脑内炎症发挥脑保护作用。
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Y E2HG0【关键词】 脑缺血再灌注；阿托伐他汀；细胞凋亡；炎症
_J+R ^&B09K6A o+Tc5y4q0 NF?κB是一种广泛存在于真核细胞中的转录因子，现已证实脑缺血损伤可使NF?κB激活，NF?κB直接或间接地参与脑缺血损伤机制过程。他汀类药物(statins)即3?羟基?3?甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG?CoA)还原酶抑制剂，是一类强效降胆固醇药物，该类药物除能明显调节血脂外，还具有多向性抗动脉粥样硬化作用，在心脑血管疾病的防治方面有着广泛的作用〔1～3〕。他汀类药物不但可以减少脑卒中的发生，而且还可以改善脑卒中患者的临床预后。本实验采用阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注进行治疗干预，观察其对大鼠脑组织炎症因子IL?1β、抗凋亡因子Livin和NF?κB表达的影响，探讨阿托伐他汀的脑保护作用机制。
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I^o ]} PN C MG0 1 材料与方法
中国论文网2V,u `@V)x u ^+O:A g/l5V f:Ut0 1.1 动物及分组
中国论文网 c4h+b/`!h]N)H,n+l2J/g!~0 Wistar大鼠30只，雌性，体质量200～250 g，第三军医大学野战医院动物研究所提供，动物中心许可证号：渝实动设施准第260号。Wistar大鼠适应性喂养1 w，经筛选，大鼠按抓取随机原则分为5组，即假手术组（S组），阿托伐他汀治疗组（MT组，分为缺血再灌注12和24 h），缺血再灌注组（M组，分为缺血再灌注12和24 h组），每组6只。
中国论文网+to'Z r#m ms6Gy9s怎么发表论文 中国论文网'B[:gs"U"x Zb 1.2 主要试剂及设备
!QG:]T.n.D;H O0o0中国论文网4egC;o [*F 阿托伐他汀钙片由北京红惠生物制药股份有限公司生产（生产日期为2005年9月2日，生产批号0500934，剂量20 mg／片）；白介素(IL)?1β、Livin和NF?κB试剂盒为北京搏奥森生物科技有限公司产品；TTC为Sigma产品。
中国论文网Z a)|f5g Jd中国论文网\e C0N5e 1.3 动物模型制作方法
中国论文网t7Ku*N)_:aHP中国论文网@(gS H7V m(g |H TT 参照文献〔4〕描述的大脑中动脉线栓方法制作大鼠脑缺血再灌注模型。动物苏醒后参考Longa等〔5〕的5分评分法，2分或2分以上者入选本实验。
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j7\,e_'Cyc0*?C;Y+d1v"ev0 1.4 给药方法
怎么发表论文 中国论文网pf;H4@ Zv)ehh中国论文网[yM.VW!^A b I[ 将阿托伐他汀用生理盐水稀释成 0.5 mg/ml浓度备用。S组插入0.5～1.0 cm线栓，予以等量的生理盐水灌胃；MT组在M组的基础上，于缺血后120 min及14 h分别给予阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃；M组行缺血和再灌注处理并予以等量的生理盐水灌胃。阿托伐他汀的剂量选择参考文献〔2，6〕。
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P'WM/]$` j中国论文网6E$dPQ*YV 1.5 脑梗死体积检测
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Nsc _-{9H 每组随机取大鼠5只，经过量麻醉后断头取脑，经速冻20 min后。从视交叉向后连续冠状切片，片厚2 mm。将脑片放入2％TTC溶液，37℃温箱中染色30 min，15 min翻面，甲醛固定24 h后，见正常脑组织呈红色，梗死灶则为白色。用数码相机拍照，OSIRIS图像处理软件计算各脑片右侧半脑梗死灶百分比(梗死面积/总面积)，梗死体积=各层梗死面积之和×层面厚度，计算平均值。
中国论文网2S z.An[8LPm g A$qQ|0 1.6 免疫印迹实验
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k;dLP,j)c*_ Oa中国论文网
v @utnEIf6|Yt 按10 ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用BCA法进行蛋白定量。10％的SDS?PAGE凝胶电泳，上样量为28 μg。电泳条件：4℃。电流20～30 mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22 m的硝酸纤维素膜(NC)，4℃，电流400 mA，转膜3 h。Western印迹杂交步骤如下：10％脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TYBS(20 mmol/L Tris?HCl，pH 7.5；0.15 mmol/L Nacl；0.05％Tween 20)漂洗3次，每次10 min，然后室温下与APP一抗(1∶3 000)杂交反应3 h，TTBS漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)杂交反应1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室进行X?光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与β?actin(1∶1 000)进行Western印迹杂交反应，并获得蛋白印迹结果。Western印迹条带经Gel?doc凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位吸光度值和条带面积，将各实验点的总吸光度值与对照组比较，得到相对百分数。
怎么发表论文 中国论文网 Kj,IZ8`9E1Z e中国论文网%c*Mh}+X$@ Im 1.7 逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)
中国论文网 @4W;DRx"Db中国论文网{;tH2B)z/Gfv!^T 提取各组大鼠额顶叶皮质和海马组织总RNA并定量，用DNA 酶Ⅰ处理总RNA 以去除DNA污染,各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR。IL?1β、Livin和NF?κB PCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5 μl在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为70～80 V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用Quantity One?4.4.0软件行定量分析，以目的基因与β?actin条带平均
中国论文网Hr_j,G1V1h光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。表1 IL?1β、Livin和NF?κB PCR引物设计（略）
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x"}0 1.8 统计学处理
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Z}$i 所有数据以x±s表示，全部数据采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，同一组内不同时相点的比较采用方差分析，两组之间同一时相点的比较采用t检验。
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J3H-jd|5X,R0 2 结果
中国论文网r{+L8LM"p5zM)BS ]1@f+a@+aZ5A0 2.1 阿托伐他汀对局灶性脑缺血大鼠梗死灶体积的影响
中国论文网oxU:fnV V v p中国论文网7Y5g&V \$N 与S组比较,局灶性脑缺血12、24 h，M组梗死灶体积迅速扩大(P<0.01)；与同时点M组比较，MT组梗死灶体积均有显著缩小(P<0.01)，见表2。表2 阿托伐他汀对局灶性脑缺血大鼠梗死灶体积的影响(略)
怎么发表论文 中国论文网 D |8iy l$aA?5I/D#D@c~ w0 2.2 NF?κB检测结果与分析
中国论文网8NO6s$vqWUF xt/`}+a8G0 免疫印迹法检测NF?κB结果显示，M组、MT组与S组比较，NF?κB表达水平明显增高(P<0.01）；MT组和M组比较，NF?κB值也明显降低(P<0.01），见图1。RT?PCR检测大鼠脑组织mRNA NF?κB的表达水平结果显示M组、MT组与S组比较，NF?κB表达水平明显增高(P<0.01）；MT组和M组比较，NF?κB值明显降低 (P<0.01），见图1。MT组与同时点M组比较NF?κB表达有明显升高(P<0.01)。 M组较S组NF?κB表达明显
,uQ0}+q5p M A%_`0KA0升高(P<0.01)，见表3。表3 阿托伐他汀对NF?κB、IL?1β和Livin表达的影响(略)
中国论文网!y@I&U\NLJ!KrB9\:P O!F ~0 2.3 IL?1β结果
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Q{l%k%v*V0中国论文网&?R4M wN!C%M&p/AT$f J 免疫印迹法检测结果显示，M组、MT组与S组比较，IL?1β表达水平明显增高(P<0.01）；MT组和M组比较，IL?1β值也明显降低(P<0.01），见图2。RT?PCR检测大鼠脑组织mRNA IL?1β的表达水平结果显示，M组、MT组与S组比较，IL?1β表达水平明显增高(P<0.01）；MT组和S组比较，IL?1β值明显降低 (P<0.01），见图2。MT组与同时点M组比较IL?1β表达有明显升高(P<0.01)。 M组与S组比较IL?1β表达明显升高(P
s u;G:e1S0<0.01)，见表3。
9S3sz.k)z9_X#^.?7K0 )D:R&K&})`/x;]0 2.4 Livin检测结果
4Agr7s%qjHwf0 [Rs| I6j9HB/[0 蛋白质印迹法检测结果显示，M组、MT组与S组比较，Livin值明显增高(P<0.01）；M组和MT组比较，Livin值也明显增高 (P<0.01）。RT?PCR检测大鼠脑组织mRNA Livin的表达水平与蛋白质表达水平结果具有一致性，MT组与同时点M组比较Livin表达有明显升高(P<0.01)。M组较S组Livin表达升高(P<0.01)，见图3，表3。
怎么发表论文 中国论文网`$h:t.vFC.W(od/{3 讨论
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_8@T0 中国论文网@bN PW&n 本实验复制慢性脑缺血再灌注状态，TTC染色法检查梗死程度，Longa行为学检测明显神经功能缺损症状，结果表明我们建模达到预期目的。本研究发现Livin、IL?1β、NF?κB在模型大鼠脑组织表达增高，模型组大鼠 Livin、IL?1β、NF?κB表达均在相对固定水平，而阿托伐他汀能够显著缩小脑梗死的体积，有效抑制IL?1β、NF?κB的表达，增强 Livin?2的表达，表明阿托伐他汀有效促进Livin的生物活性，降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织IL?1β、NF?κB含量，提示阿托伐他汀可以抑制细胞凋亡和神经炎症发挥脑保护作用。
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p5`b0B/|+|%\y` 细胞凋亡是脑缺血再灌注重要的病理生理机制〔7〕，缺血脑损伤程度和细胞凋亡有着直接的联系。Livin是一种新近发现的细胞凋亡因子，以其为靶点的抑制物及反义Livin能够保护细胞不进行凋亡，具有广谱和低毒的副作用，为血管性认知功能损害治疗提供了新的研究方向。Livin的作用途径有二：(1)在Fas/caspase?8诱导的死亡受体途径中，Livin不直接结合抑制caspase?8，而是直接抑制核心蛋白酶caspase?3的活性，从而抑制整条途径发挥抗凋亡作用。(2)在细胞色素C/Apof?1作用的线粒体途径，则可以直接与 caspase?9前体蛋白(pro?caspase?9)和其激活形式结合从而抑制其活性，还可以直接结合并抑制caspase?3的活性，阻断他们依次切割激活。同时阻断caspase?3对pro?aspase?9的反馈激活，抑制细胞调亡〔8～10〕。本研究表明Livin参与了脑缺血再灌注损害动物模型的病理生理机制，而阿托伐他汀有效促进Livin的生物活性，提示该药可抑制脑缺血再灌注损害大鼠细胞凋亡发挥脑保护作用。
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u0 NF?κB是一种广泛存在于真核细胞中的转录因子，现已证实脑缺血损伤可使NF?κB激活〔11〕。NF?κB活化后能调控一系列基因的表达，如炎性细胞因子TNF?α、IL?1β等，引发炎症级联反应〔12，13〕；NF?κB活化激活大量氧化活性物质释放，氧化应激产生，自由基瀑布效应等，加速细胞凋亡进程〔7，14〕，NF?κB直接或间接地参与脑缺血损伤机制过程。脑缺血后发生的NF?κB活化后引发的一系列病理生理机制是脑损伤的重要环节。我们通过对脑缺血再灌注大鼠脑组织IL?1β、NF?κB检测，发现IL?1β、NF?κB在脑缺血再灌注大鼠脑组织中的表达增高，脑缺血再灌注大鼠 IL?1β、NF?κB表达均在相对固定水平。阿托伐他汀治疗后，IL?1β、NF?κB的表达显著降低，表明阿托伐他汀对脑缺血再灌注的脑保护作用是通过抑制脑缺血再灌注大鼠脑内炎症这一途径实现的。
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F0 总之，本实验证实阿托伐他汀能有效抑制IL?1β、NF?κB的表达，增强Livin的表达，降低细胞凋亡数目对于脑缺血再灌注是一种有效的脑保护剂。
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